萬良財 李琰 謝南屏 李永賀

鼓室硬化(tympanosclerosis)是指中耳黏膜固有層發(fā)生的鈣化病變，系中耳黏膜慢性感染或炎癥的結(jié)果,目前鼓室硬化的發(fā)病機理還不十分明了。為了解豚鼠鼓室硬化中耳黏膜的超微結(jié)構(gòu)特點及進一步了解豚鼠鼓室硬化的發(fā)病機理，本研究對鼓室硬化造模成功的豚鼠中耳腔不同部位黏膜組織行電鏡觀查，報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康雜色豚鼠8只，雌雄不拘，體重為250～350 g，排除外耳道、鼓膜、中耳等感染。其中6只(8耳)行鼓室硬化造模(鼓室硬化組)，2只(4耳)為正常對照組(對照組)。

1.2鼓室硬化豚鼠造模方法 受試豚鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(35 mg/kg)施行全身麻醉，安爾碘消毒雙耳及外耳道皮膚，用1 ml無菌注射器抽取1×108個/L金黃色葡萄球菌液100 μl，顯微鏡下經(jīng)鼓膜緊張部后下象限向鼓室內(nèi)注射，觀察6個月以上,觀察期間不行任何治療[1]。造模成功標準:顯微鏡下鼓膜穿孔邊緣或鼓室腔可見鈣化斑。

1.3中耳黏膜取材 將鼓室硬化組及對照組豚鼠分別以1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg) 腹腔注射麻醉，往聽泡內(nèi)注入2．5%戊二醛1～2 ml，斷頭處死豚鼠，快速取出聽泡。使用耳科電鉆磨開聽泡，顯微鏡下剝?nèi)≈卸?，分別取咽鼓管、鼓室、鼓岬、鼓竇、乳突氣房5處黏膜組織。

1.4電鏡標本的制備 將固定液及所用容器預冷后，在1分鐘內(nèi)將所取中耳黏膜組織切成2 mm×2 mm×1 mm大小，浸入2.5﹪戊二醛固定液中固定3小時(前固定)，經(jīng)0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)漂洗后予2﹪四氧化鋨固定2小時(后固定)，經(jīng)0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)漂洗；30﹪酒精脫水8分鐘，50﹪酒精脫水8分鐘，70﹪酒精脫水8分鐘，90﹪酒精脫水12分鐘，100﹪酒精脫水3次，每次12分鐘，行梯度脫水；脫水劑:包埋劑=1:1，1小時；脫水劑:包埋劑=1:2，2小時；純包埋劑，5小時；將標本轉(zhuǎn)入塑料囊，70 ℃，10小時，Epon812環(huán)氧樹脂包埋；超薄切片，面積約0.2～0.3 mm2；予醋酸鈾及檸檬酸鉛染色，在干凈培養(yǎng)皿內(nèi)放置蠟板，把醋酸鈾染液滴在蠟板上，將撈有切片的銅網(wǎng)覆于染液上30分鐘，然后用雙蒸水沖洗﹑吸干。再銅網(wǎng)覆于檸檬酸鉛染液上10分鐘，然后用雙蒸水沖洗﹑吸干后電鏡下觀察。

2 結(jié)果

正常豚鼠中耳黏膜由上皮細胞及上皮下層組成, 上皮下層結(jié)構(gòu)主要有膠原纖維、纖維細胞，膠原纖維少,排列較整齊；纖維細胞形態(tài)大小正常，胞核中染色質(zhì)染色淺且均勻,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體形態(tài)正常,見線粒體嵴，無溶酶體，上皮層及上皮下層均未見鈣質(zhì)沉著(圖1)。鼓室硬化豚鼠中耳不同部位黏膜均見變性的成纖維細胞散在分布,成纖維細胞不規(guī)則變形、伸長、變性，胞核形狀不規(guī)則，胞核含深染且染色不均勻的染色質(zhì), 異染色質(zhì)常聚集分布于核周邊。在核周的細胞漿內(nèi)有較多的變性的溶酶體及腫脹的線粒體，線粒體嵴消失，溶酶體染色較線粒體深，線粒體和溶酶體內(nèi)均可見鈣質(zhì)沉著。細胞漿內(nèi)可見張力絲和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大部分擴張成圓球狀或橢圓囊狀,另外，細胞漿內(nèi)還可見中心體。細胞基質(zhì)見膠原纖維顯著增生，各個方向上均可見，交叉成網(wǎng)或互相平行呈半螺旋形排列，其內(nèi)含大量無定形的富含電子小囊泡，伴或不伴鈣化,有時可因濃聚而呈現(xiàn)空影(圖2)。

圖1正常豚鼠中耳黏膜電鏡圖纖維細胞形態(tài)正常,線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常,膠原纖維少,未見鈣化(×50 000)(1a)。 胞核染色均勻,胞漿內(nèi)見大量線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng),未見溶酶體及鈣化(×40 000)(1b)
圖2鼓室硬化豚鼠中耳黏膜電鏡圖伸長退變的纖維細胞及大量膠原纖維，溶酶體、線粒體、細胞基質(zhì)小囊泡見鈣化(×15 000)(2a)。大量膠原纖維增生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張成囊狀,溶酶體、線粒體見鈣化(×25 000)(2b)

3 討論

鼓室硬化是中耳黏膜長期受慢性炎癥刺激的結(jié)果，目前人的鼓室硬化的研究已較深入，通常認為與遺傳因素、高鈣血癥、氧自由基﹑鈣通道異常等因素有關(guān)[2～5]。Wielinga等[6]認為鼓室硬化發(fā)生可分為三個階段，即：黏膜膠原纖維分解、透明斑塊形成、鈣化發(fā)生。人鼓室硬化中耳黏膜電鏡特點已有報道[7],但鼓室硬化豚鼠中耳黏膜的透射電鏡特點少見文獻報道。Mann等[8]認為豚鼠中耳黏膜類似于人中耳黏膜，由上皮細胞及上皮下層組成,上皮下層結(jié)構(gòu)主要有膠原纖維、毛細血管、淋巴管和神經(jīng)，主要的細胞成分是纖維細胞，偶爾也可見到肥大細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和漿細胞。

從文中結(jié)果看，豚鼠鼓室硬化中耳黏膜成纖維細胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大部分擴張成圓球狀或橢圓囊狀,這可能與成纖維細胞的變性有關(guān)。細胞基質(zhì)膠原纖維顯著增生，部分區(qū)域電鏡下可呈島狀改變，這可能與該區(qū)域膠原纖維降解破壞有關(guān)，這一特征與人鼓室硬化中耳黏膜透射電鏡特點非常相似[1]。另外與對照組顯著不同的是鼓室硬化黏膜成纖維細胞外有脂肪顆粒，在膠原纖維束間大量內(nèi)含無定形的富含電子小囊泡常位于靠近基底膜的上皮下層。Mann等[8]認為小囊泡有部分來源于溶酶體。在某些特定的情況下，如感染或創(chuàng)傷可導致細胞鈣離子濃度異常增高而損害細胞并伴有溶酶體釋放至胞外，而胞外含堿性磷酸酶的小囊泡在鈣化過程中起重要作用，它是鈣化斑的結(jié)晶中心，鈣化斑是由磷酸鈣結(jié)晶形成的。本研究發(fā)現(xiàn)豚鼠鼓室鈣化可發(fā)生于胞內(nèi)外，胞外通常好發(fā)于細胞基質(zhì)小囊泡；胞內(nèi)通常發(fā)生于線粒體、溶酶體及脂質(zhì)顆粒內(nèi)的磷脂結(jié)構(gòu)。

鼓室硬化通常是由于中耳結(jié)締組織長期受炎癥刺激而發(fā)生的營養(yǎng)不良性鈣化。陳杰等[9]認為細胞內(nèi)鈣化起始于壞死細胞的線粒體,當細胞損傷后膜通透性增加,鈣離子內(nèi)流增加，線粒體攝取鈣也增加；而細胞外鈣化則始于小囊泡內(nèi)來源于變性細胞的磷脂,鈣在這些小囊泡內(nèi)通過同小囊泡膜的磷脂結(jié)合而被濃縮，磷脂經(jīng)磷脂酶降解形成磷酸鹽。損傷和壞死組織中變性的蛋白質(zhì)極易與磷酸鹽離子結(jié)合,再與鈣離子形成磷酸鈣沉淀。另外Mann等[10]通過用鈣拮抗劑抑制鼓室硬化發(fā)生的實驗研究得出：當中耳受炎癥等刺激后,細胞膜受損，細胞內(nèi)的三磷酸腺苷池會耗竭，細胞鈣超載導致細胞壞死，結(jié)果細胞內(nèi)的基質(zhì)小胞會釋放到細胞外間隙中成為鈣化形成的中心，細胞外基質(zhì)小囊胞具有鈣親和力，使之成為上皮下鈣化的結(jié)晶中心。本研究電鏡下所見中耳黏膜鈣化通常發(fā)生的部位也證實了上述觀點。

本研究結(jié)果顯示，豚鼠鼓室硬化超微結(jié)構(gòu)與人鼓室硬化超微結(jié)構(gòu)極相似，細胞內(nèi)及胞間基質(zhì)均有鈣化。本研究動物模型為研究人鼓室硬化發(fā)病機理提供了較好的模型。

4 參考文獻

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9 陳杰，李甘地.細胞、組織的損傷[M].見:陳杰,主編.病理學.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.22～30.

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