李 靜 孔為民 李麗英 牛聚偉 張衛(wèi)華

子宮內(nèi)膜癌特別是不能手術(shù)的中晚期(ⅢA～ⅣB期)子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后較差,因此，探討更有效的治療方法顯得尤為必要。本研究探討了順鉑或紫杉醇聯(lián)合放射線同步作用對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞系的抑制情況及其可能機(jī)制，為進(jìn)一步動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞株系北京大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。紫杉醇為注射液，為?？谑兄扑帍S有限公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)基為美國(guó)Invitrogen Corporation 公司生產(chǎn)的GIBCO品牌的 DMEM高糖培養(yǎng)基。胎牛血清由德國(guó)Biochrom公司生產(chǎn)的特級(jí)胎牛血清。胰蛋白酶購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。噻唑藍(lán)(MTT)由美國(guó)Amresco公司生產(chǎn)。RNA酶為美國(guó)Sigma 公司生產(chǎn)。碘化丙啶(PI)為美國(guó)Sigma 公司生產(chǎn)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀系美國(guó)基因有限公司生產(chǎn)，型號(hào)ELX800。數(shù)字彩色圖像照相機(jī)由德國(guó)Leica公司制造，型號(hào)DFC300FX。流式細(xì)胞儀為Beckman-Coulter公司生產(chǎn)的Coulter Eplcs XL流式細(xì)胞儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞株，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、200 U/ml谷氨酰胺、100 U/ml青霉素及100 U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中。用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定、呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分為6個(gè)組：對(duì)照組，紫杉醇IC10濃度組，紫杉醇IC50濃度組，單純放療組，紫杉醇IC10濃度+放療組，紫杉醇IC50濃度+放療組。

1.2.2 紫杉醇作用 24 h的10%藥物致死劑量(24 hIC10)及24 h的50%藥物致死劑量(24 h IC50)的選擇調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml，以200μl/孔接種于96孔板，另設(shè)空白調(diào)零孔。于飽和濕度條件下5%CO237℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，紫杉醇按照終濃度2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、12 μmol/L、16 μmol/L、20 μmol/L、24 μmol/L、28 μmol/L、32 μmol/L的濃度梯度，每孔加入各濃度化療藥物100 μl，每濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，對(duì)照孔加入藥物溶劑(0.9%氯化鈉注射液)100μl。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,采用MTT法測(cè)各孔光吸收值(OD值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 各組抑制率比較 消化離心HEC-1A 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml，以200 μl/孔接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白調(diào)零孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h，加入相應(yīng)濃度的化療藥物，另外放射線照射組加入相應(yīng)濃度的化療藥物后立即行60Co射線照射，照射劑量為4 Gy。照射后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48更換培養(yǎng)基，同時(shí)重新加入相應(yīng)濃度的化療藥物。分別于24 h、48 h、72 h、96 h于倒置顯微鏡下,用型號(hào)為DFC300FX的數(shù)字彩色圖像照相機(jī)，取每孔中心點(diǎn)視野拍攝細(xì)胞圖片，觀察細(xì)胞形態(tài)改變。 采用MTT法檢測(cè)各組OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)比較各組細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況 將濃度為1×106/ml的細(xì)胞以2 ml/孔接種于6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)對(duì)照孔。收集各處理組培養(yǎng)48 h的含藥培養(yǎng)基及PBS洗液，消化離心細(xì)胞，加入終濃度為70%的-20℃酒精，-20℃過夜固定，離心棄酒精，加1 ml RNA酶A(終濃度為100 μg/ml),置于37℃培養(yǎng)30 min，加0.1 ml碘化丙啶(PI)(終濃度為50 μg/ml)避光染色至少30 min,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

相對(duì)抑制率(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白調(diào)零組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白調(diào)零組OD值)。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，概率分析法計(jì)算IC10值及IC50值，采用t檢驗(yàn)比較各組的OD值及抑制率。應(yīng)用EXPO32 ADC 1.1C統(tǒng)計(jì)軟件分析流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇對(duì)HEC-1A細(xì)胞作用24 h的IC10值及IC50值

應(yīng)用MTT法檢測(cè)，采用SPSS概率法計(jì)算，紫杉醇對(duì)HEC-1A細(xì)胞系作用24 h后的IC10值及IC50值分別為5.87[95%可信區(qū)間(4.28，7.28)]及13.83[(95%可信區(qū)間(12.18，15.25)]。不同濃度梯度的紫杉醇作用于子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞株24 h后的OD值及抑制率見表1。不同濃度紫杉醇抑制率曲線見圖1。

表1 紫杉醇各濃度的OD值及抑制率

圖1 不同濃度紫杉醇抑制率曲線圖

2.2 各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變

肉眼見培養(yǎng)基顏色隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸變黃。低倍(10×10倍)倒置顯微鏡下可見到經(jīng)放化療作用后細(xì)胞逐漸出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。并隨用時(shí)間延長(zhǎng)，被破壞的細(xì)胞增多。高倍(10×20倍)倒置顯微鏡下可見部分細(xì)胞體積改變，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，裂解成碎片。

2.3 不同濃度紫杉醇及放療不同時(shí)間對(duì)HEC-1A細(xì)胞的抑制作用

單純放療組、紫杉醇IC10濃度+放療組、紫杉醇IC50濃度+放療組作用于HEC-1A細(xì)胞24 h、48 h、72 h、96 h OD值及抑制率見表2。

2.4 各組48細(xì)胞周期改變及凋亡情況

經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，對(duì)照組、紫杉醇IC10濃度組、紫杉醇IC50濃度組、單純放療組、紫杉醇IC10濃度+放療組和紫杉醇IC50濃度+放療組48 h S期和G2期細(xì)胞比例及凋亡細(xì)胞比例見表3。

3 討論

由于放射治療是對(duì)老年患者或合并有嚴(yán)重內(nèi)科疾患不能接受手術(shù)治療或有手術(shù)禁忌證的子宮內(nèi)膜癌患者的重要治療方法，而子宮內(nèi)膜癌對(duì)放射線的敏感性又相對(duì)差于宮頸癌[1]，因此，對(duì)同步放化療能否提高放射線對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抑制作用，從而提高不能手術(shù)的子宮內(nèi)膜癌患者的治療效果的研究具有重要意義。

3.1 紫杉醇同步放化療對(duì)子宮內(nèi)膜癌的抑制作用

經(jīng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇用于宮頸癌的同步放化療已初步證實(shí)具有良好療效[2]。紫杉醇作為1種新型的抗腫瘤藥，對(duì)各種進(jìn)展期的人子宮內(nèi)膜癌有緩解作用,在人子宮內(nèi)膜癌的有效率最高可達(dá)80%[3]。目前僅有很少關(guān)于子宮內(nèi)膜癌同步放化療(CRT)的臨床試驗(yàn)研究。RTOG-9708試驗(yàn)[4]研究證實(shí)對(duì)內(nèi)膜癌患者放療同時(shí)予順鉑50 mg/m2，第1天，第28天的方案可行，其局部控制效果較好，放化療療效具有增加效果，但是仍發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其遠(yuǎn)期療效尚待進(jìn)一步隨機(jī)試驗(yàn)研究證實(shí)。Kelly等[5]的研究結(jié)果表明子宮內(nèi)膜癌術(shù)后鉑類盆腔同步放化療,與術(shù)后傳統(tǒng)放療比較,ⅢC期以下癌,同步放化療優(yōu)于傳統(tǒng)放療,ⅢC期及以上的晚期癌,同步放化療與傳統(tǒng)放療無(wú)差異。GOG-9907研究[6]報(bào)道順鉑(25 mg/m2)加紫杉醇(20 mg/m2)周療同時(shí)予全腹外照射方案可行，但是有中度的急性及慢性胃腸道反應(yīng)。從以上幾個(gè)臨床試驗(yàn)的初步結(jié)果可以看出，子宮內(nèi)膜癌的同步放化療似乎有效，但其療效尚缺乏實(shí)驗(yàn)研究的證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明小劑量(24 h IC10濃度)的紫杉醇能夠增加放射線對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞的抑制作用；大劑量(24 h IC10濃度)的紫杉醇與放射線對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制作用。研究結(jié)果從體外實(shí)驗(yàn)角度證實(shí)了紫杉醇同步放化療對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞系有協(xié)同抑制作用。

3.2 紫杉醇或順鉑同步放化療協(xié)同抑癌作用機(jī)理

本實(shí)驗(yàn)提示小劑量紫杉醇與放射線的協(xié)同作用機(jī)制可能主要與其能夠使細(xì)胞周期停滯于G2期，從而增加細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性有關(guān)。Randall等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用與其能夠誘導(dǎo)凋亡相關(guān)。Carlos[8]報(bào)道，紫杉醇對(duì)前列腺癌的抑制作用主要是使細(xì)胞停滯于G2/M期，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著紫杉醇劑量的增加，停滯于G2期的細(xì)胞比例增加，但是凋亡細(xì)胞比例沒有明顯增加，分析可能是由于本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的為晚期凋亡細(xì)胞比例，不除外檢測(cè)時(shí)細(xì)胞還處于凋亡早中期，DNA還沒有從細(xì)胞內(nèi)漏出，從而不能在檢測(cè)圖中體現(xiàn)出來(lái)。

表2 各組不同時(shí)間OD值及抑制率比較

表3 各組48 h S期和G2期細(xì)胞比例及凋亡細(xì)胞比例(%)

總之，目前，關(guān)于子宮內(nèi)膜癌的同步放化療的國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，我們的體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示紫杉醇同步放化療對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用，其作用機(jī)理是小劑量或大劑量紫杉醇能夠使細(xì)胞周期停滯于G2期，使細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性增加。其療效及作用機(jī)理尚待進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)研究證實(shí)。

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