賈曉斌， 宋師花， 陳 彥， 王麗靜， 封 亮

（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥新型給藥系統(tǒng)重點實驗室，江蘇 南京 210028;3.國家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點研究室，江蘇南京 210028）

靈芝是多孔菌科靈芝屬真菌，子實體為其藥用部位之一。其中靈芝三萜類成分是靈芝的主要有效成分，文獻報道［1-2］，具有抗腫瘤、抗氧化、保肝、鎮(zhèn)痛等藥理作用，其中靈芝酸B是靈芝中一種重要的三萜類成分［3］。

醇回流提取法是工業(yè)上從靈芝子實體中提取三萜類成分的常用方法，但其有提取時間長、提取次數(shù)多，浪費有機溶劑并有殘留等諸多缺點。超臨界CO2流體萃取具有萃取時間短，萃取次數(shù)少，綠色無污染等優(yōu)點，具有很好的發(fā)展前景。關(guān)于靈芝子實體中三萜類成分的提取工藝，既有醇回流提取法最佳工藝的報道［4-5］，也有超臨界CO2萃取法最佳條件的報道［6］，但卻未見這二種提取方法比較的研究，因此本文在文獻報道的基礎(chǔ)上，以醇回流提取的最佳條件和超臨界CO2流體萃取的最佳條件分別提取靈芝中三萜類成分，然后通過比較HPLC圖譜、RP-HPLC法測定的靈芝酸B含量、可見分光光度法測定的靈芝三萜含量、固形物含量等4個指標(biāo)，綜合、全面的評價這兩種提取方法，以期為工業(yè)提取靈芝子實體中三萜類成分提供更多、更新、更科學(xué)的依據(jù)。

1 儀器

HA221-40（50）-25型超臨界萃取裝置（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司）;Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent科技公司），包括:在線脫氣機，四元梯度泵，自動進樣器，恒溫柱溫箱，DAD檢測器，Agilent 1200化學(xué)工作站;METLER TOLEDO分析天平（精密度萬分之一和百萬分之一，METLER TOLEDO分析儀器有限公司）;UV-2802型紫外可見分光光度計（上海尤尼克儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品液的制備

2.1.1 SFE（CO2）提取液 根據(jù)課題組前文［6］研究結(jié)果，選擇最佳條件:將靈芝子實體切片再進一步粉碎過12目篩，取靈芝子實體顆粒100 g裝入1 L的萃取釜中，設(shè)置萃取釜壓力為25 MPa，溫度為45℃，夾帶劑為95%乙醇，用量為300 mL，萃取時間為1.5 h;設(shè)置分離釜I壓力為7 MPa，溫度為50℃;設(shè)置分離釜Ⅱ壓力為4 MPa，溫度為36℃，CO2流量為30 L/h。萃取結(jié)束后，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液，加95%乙醇定容至500 mL，即得。

2.1.2 醇回流提取液［5］將靈芝子實體粉碎過12目篩，取100 g，加10倍量95%乙醇，加熱回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液，過濾，回收溶劑，用乙醇定容至500 mL，即得。

2.2 供試液的制備［7］

精密量取上述SFE（CO2）提取液和醇回流提取液各50 mL，回收乙醇，殘渣以50 mL氯仿溶解，用飽和NaHCO3溶液萃取4次（50 mL×4），合并碳酸氫鈉溶液，用質(zhì)量分數(shù)為36%的鹽酸調(diào)節(jié)pH 2～3，用氯仿萃取4次（50 mL×4），合并氯仿液，減壓蒸干，殘渣用無水乙醇溶解并定容到50 mL，搖勻，分別得到靈芝超臨界CO2流體萃取三萜類成分（supercritical fluid extraction and acidic components，SFE-AC）和靈芝醇回流提取三萜類成分（ethanol-soluble and acidic components，ES-AC）的供試液（每1 mL相當(dāng)于原藥材0.2 g）。

2.3 HPLC色譜圖的比較

2.3.1 色譜條件 色譜柱:ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相:乙腈-0.05%磷酸;梯度洗脫，其時間程序為:0→40→60→80，乙腈體積分數(shù)相應(yīng)為27%→27%→35%→45%;檢測波長:257 nm，流速:1.0 mL/min，柱溫:30℃，進樣量:10 μL。

2.3.2 HPLC供試品溶液的制備 分別取SFE-AC供試液和ESAC供試液適量，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。HPLC圖譜分別見圖1和圖2。

圖1 靈芝超臨界CO2流體萃取三萜類成分HPLC色譜

圖2 靈芝醇回流提取三萜類成分HPLC色譜

因為在80 min后基本無色譜峰出現(xiàn)，說明三萜類成分在80 min內(nèi)基本上已分離出來，所以選擇分析時間為80 min。

由圖1和圖2可以看出，在樣品進樣濃度和體積相同的條件下，這兩種提取方法所獲得的HPLC圖譜的出峰數(shù)量、保留時間基本保持相同，色譜峰峰形也極其相似。說明超臨界CO2流體萃取和傳統(tǒng)的醇回流提取這兩種提取方法所提取出的目標(biāo)產(chǎn)物基本一致。

2.4 靈芝酸B含量的比較

2.4.1 色譜條件 同2.3.1項下色譜條件。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制［6］精密稱取靈芝酸B對照品適量，置量瓶中，加甲醇適量使溶解，定容至5 mL，制成靈芝酸B質(zhì)量濃度為0.475 mg/mL的高濃度對照品貯備液。吸取靈芝酸對照品高濃度貯備液適量，分別制成含靈芝酸B質(zhì)量濃度分別為 0.047 5，0.095 0，0.142 5，0.190 0，0.237 5 mg/mL的對照品溶液;分別吸取各濃度對照品溶液10 μL進樣，測定其峰面積。以對靈芝酸B對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得靈芝酸B標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=911.04X－3.758，r=0.999 9，結(jié)果表明，靈芝酸B在0.047 5～0.237 5 mg/mL呈良好的線性關(guān)系。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取濃度為0.095 0 mg/mL的靈芝酸B對照品溶液10 μL，按2.3.1項下色譜條件重復(fù)進樣5次，記錄峰面積值，RSD為0.65%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一批樣品，平行制備5份供試品溶液，進樣分析，計算靈芝酸B的含量，其含量的RSD為1.34%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h時間點進樣分析，記錄峰面積值，其RSD為0.86%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

對患者護理效果做護理問卷調(diào)查,主要分為以下三種結(jié)果:顯效:指患者嘔血、黑便等臨床癥狀完全改善,出血現(xiàn)象停止;有效:指患者嘔血、黑便等臨床癥狀基本改善,偶爾有出血現(xiàn)象;無效:指患者嘔血、黑便等臨床癥狀沒有改善,出血現(xiàn)象加重?？傆行?顯效率+有效率。

2.4.6 靈芝酸B的含量測定 分別取SFE-AC供試液和ESAC供試液適量，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，分別進樣10 μL，計算靈芝酸B的含量，結(jié)果見表1。

表1 靈芝酸B的含量測定

從表1可以看出，超臨界CO2萃取法和醇回流提取法對靈芝酸B的提取率相似，分別為0.363 mg/g和0.331 mg/g，其中以超臨界CO2萃取法萃取的靈芝酸B含量稍高，但兩者之間無顯著性差異。

2.5 靈芝三萜含量的比較

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取熊果酸對照品2.21 mg，置于10 mL量瓶中，加無水乙醇適量使溶解，定容，搖勻，即得。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 參照文獻［6］，精密吸取上述濃度為 0.221 mg/mL 的對照品溶液 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，分別置10 mL具塞試管中（同時吸取0.8 mL的無水乙醇作為空白對照），置沸水浴中揮干溶劑無水乙醇，再依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液各0.5 mL、再分別加入高氯酸各0.8 mL，密塞，置60℃水浴中加熱15 min，取出，置冰水浴中冷卻5 min，然后分別加冰醋酸5 mL，搖勻，以無水乙醇管作為空白對照，在543 nm處測定吸光度，以熊果酸對照品量（μg）為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為:Y=0.005 9X+0.035 1，r=0.999 5，結(jié)果表明熊果酸在44.2～154.7 μg呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5.3 含量測定 分別取SFE-AC供試液和ESAC供試液各60 μL，按“2.4.2”項下方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算靈芝三萜的含量，結(jié)果見表2。

表2 靈芝三萜的含量測定

從表2可以看出，超臨界CO2萃取法和醇回流提取法對靈芝三萜的提取效率分別為1.33 mg/g和1.26 mg/g，提取效率以超臨界CO2萃取法略高，但兩者之間并無顯著性差異。

2.6 固形物含量的測定

精密量取SFE-AC供試液和ESAC供試液各10 mL，置已干燥恒重的蒸發(fā)皿中，先放置沸水浴中揮干溶劑，然后再放置105℃烘箱中干燥至恒重，稱定重量，計算固形物的含量，結(jié)果見表3。

表3 固形物含量的測定

從表3可以看出，超臨界CO2萃取法和醇回流提取法所得得固形物含量分別為11.29 mg/g和16.30 mg/g，以醇回流法得到的固形物含量較高。

3 討論

3.1 本文通過HPLC圖譜、RP-HPLC法測定的靈芝酸B含量、可見分光光度法測定的靈芝總?cè)坪?、固形物含量?個指標(biāo)的比較，可知超臨界CO2流體萃取法和醇回流提取法所得到的目標(biāo)產(chǎn)物一致;靈芝酸B含量、靈芝三萜含量雖以超臨界CO2萃取法稍高于醇回流提取法，但并無統(tǒng)計學(xué)差異，所以這兩種提取方法所得的靈芝酸B含量、靈芝三萜含量相近;固形物含量以醇回流法較高，這表明該方法提取出的有效成分以外的雜質(zhì)較多。綜合以上4個指標(biāo)的實驗結(jié)果，可知這兩種方法對靈芝中三萜類成分的提取效果相似，可以用超臨界CO2萃取法取代傳統(tǒng)的醇回流提取法提取靈芝子實體中三萜類成分。

3.2 三萜類化合物難溶于水，易溶于有機溶劑，所以靈芝三萜類成分的提取方法，除了本文中的以乙醇為溶劑進行提取，還可以用甲醇、氯仿等有機溶劑提取。但因甲醇、氯仿毒性比乙醇大，不宜用于工業(yè)化生產(chǎn)，故本文僅選擇將乙醇回流提取和超臨界CO2進行比較。

3.3 與傳統(tǒng)溶劑提取法相比，超臨界CO2流體萃取法具有突出的優(yōu)點，萃取溫度低，可有效防止熱敏性物質(zhì)的氧化和逸散;綠色無污染，不使用或較少使用有機溶劑，使用的CO2無味、無臭、無毒，安全性好;操作簡單，萃取參數(shù)容易控制。

3.4 超臨界CO2流體萃取法和醇回流法得到的提取物HPLC圖譜極其相似，是因為以超臨界CO2流體萃取法萃取靈芝子實體中三萜類成分時，使用乙醇作為夾帶劑，改變了超臨界CO2流體的極性。張潔等［9］也報道靈芝子實體超臨界CO2流體提取物和甲醇提取物在高效液相色譜的色譜圖中具有相似的峰形。

［1］黃書銘，楊新林，王幫武，等.靈芝醇溶酸性組分的抗腫瘤作用［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2004，16（2）:146-148.

［2］羅 俊，林志彬.靈芝三萜類化合物藥理作用研究進展［J］.藥學(xué)學(xué)報，2002，37（7）:574-578.

［3］劉思妤，王 艷，何蓉蓉，等.靈芝的化學(xué)成分［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2008，25（3）:183-187.

［4］袁 媛，楊 毅，開桂青，等.靈芝三萜提取工藝研究［J］.安徽化工，2007，33（4）:27-29.

［5］許海燕，侯敏娜，劉 劍.靈芝總?cè)铺崛」に囇芯浚跩］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，30（3）:43-44.

［6］宋師花，賈曉斌，陳 彥，等.超臨界CO2萃取靈芝子實體中三萜類成分［J］.中國中藥雜志，2008，33（17）:2104-2107.

［7］李保明，劉 超，王洪慶，等.靈芝總?cè)扑岷繙y定方法的研究［J］.中國中藥雜志，2007，32（12）:1234-1236.