微柱凝膠免疫法檢測(cè)人血中美洛西林針劑的IgM和IgG抗體

林觀樣，潘曉鋒，郭 紅，林聰麗

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000）

美洛西林針劑中含有半抗原性質(zhì)的化學(xué)成分，這些組分進(jìn)入血液后可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，習(xí)慣上稱為美洛西林抗體。長(zhǎng)期以來，國(guó)內(nèi)外對(duì)美洛西林IgE抗體關(guān)注較多，而對(duì)美洛西林IgM和IgG抗體缺乏足夠重視。一方面，臨床上有些藥害事件與這些抗體密切相關(guān)；另一方面，臨床上又缺乏檢測(cè)IgM和IgG抗體的實(shí)用技術(shù)，給評(píng)估用藥人群中美洛西林的免疫狀況帶來困難。為此，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[1-2]，嘗試用微柱凝膠免疫法測(cè)定美洛西林鈉的IgM和IgG抗體，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LISS/Coombs/IgG+C3d微柱凝膠卡（瑞士DiaMed公司，批號(hào)為50531.25.55）；卡式定速離心機(jī)（瑞士達(dá)亞美公司）；37℃恒溫孵育器（瑞士達(dá)亞美公司）。注射用美洛西林鈉（山東瑞陽(yáng)制藥有限公司，批號(hào)為05101401）；pH為9.6的巴比妥緩沖液（自制）；O型血液（采自健康獻(xiàn)血者，肝素抗凝，冷藏備用）；待檢血液（采自住院患者和健康獻(xiàn)血者，肝素抗凝，冷藏備用）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

等份吸取20名O型血健康獻(xiàn)血者新鮮血液，混勻后取10 mL壓積紅細(xì)胞，置試管中，加90 mL生理鹽水，混勻，在2 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心2 min，棄去上清液，用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，即成不含藥物的空白O型人紅細(xì)胞，備用。將1 g美洛西林鈉注射劑溶于pH為9.6的巴比妥緩沖液60 mL中，加入4 mL空白O型人紅細(xì)胞，室溫孵育1 h，用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，即成美洛西林化紅細(xì)胞。用適量生理鹽水配成2%紅細(xì)胞懸液，備用。按上述操作方法，用生理鹽水代替美洛西林鈉注射劑制成2%空白紅細(xì)胞懸液，作為陰性對(duì)照液，備用。將待檢血液在2 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心2 min，取上清液即為待檢血清。吸取待檢血清適量，置56℃恒溫水浴箱中，保溫30 min滅活血清中的補(bǔ)體，作為補(bǔ)體滅活的血清對(duì)照組。

2.2 檢測(cè)方法

分別取2%美洛西林化紅細(xì)胞懸液40 μL置微柱凝膠柱上，加100 μL的待檢血清置37℃恒溫孵育器中，孵育20 min，置卡式定速離心機(jī)中以1 030 r/min的速度離心10 min，觀察凝集現(xiàn)象。同時(shí)，分別用2%空白紅細(xì)胞懸液及生理鹽水代替美洛西林化紅細(xì)胞懸液作對(duì)照，其余操作相同，記錄結(jié)果，考察抗原制備情況。另外，分別用補(bǔ)體滅活的血清及生理鹽水代替待檢血清，依次用美洛西林化紅細(xì)胞、空白紅細(xì)胞和生理鹽水測(cè)試，其余操作相同，記錄凝集結(jié)果，考察補(bǔ)體對(duì)本檢測(cè)方法的干擾情況。所有的凝集試驗(yàn)都做2次。

2.3 陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

離心后，紅細(xì)胞群完全沉積于凝膠柱底部者為陰性，停留于凝膠柱上部者為陽(yáng)性，分布于凝膠柱中間者為弱陽(yáng)性。微柱凝膠免疫結(jié)果見圖1。

圖1 微柱凝膠免疫結(jié)果圖

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

76份待檢血清經(jīng)2次平行檢測(cè)，判定為陽(yáng)性7份，弱陽(yáng)性2份，陰性67份。2次檢測(cè)結(jié)果中陽(yáng)性、陰性比例完全一致，表現(xiàn)為陽(yáng)性、陰性的血液標(biāo)本號(hào)完全相同。2份弱陽(yáng)性系紅細(xì)胞群在凝膠柱中的位置有點(diǎn)變化，經(jīng)第3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果還是弱陽(yáng)性，因此計(jì)為陽(yáng)性。

2.5 干擾試驗(yàn)結(jié)果

待檢血清、補(bǔ)體滅活血清和生理鹽水對(duì)非美洛西林化紅細(xì)胞都表現(xiàn)為陰性，提示兩種血清對(duì)上述方法制備的多人混合的健康獻(xiàn)血者O型人紅細(xì)胞均無凝集反應(yīng)。待檢血清、補(bǔ)體滅活血清和生理鹽水對(duì)美洛西林化紅細(xì)胞的凝集結(jié)果一致，表現(xiàn)為陽(yáng)性、陰性的血液標(biāo)本號(hào)完全相同（見表1），說明待檢血清中的補(bǔ)體及其他組分對(duì)陽(yáng)性反應(yīng)的結(jié)果沒有干擾。結(jié)合陰性對(duì)照組的結(jié)果，可確定陽(yáng)性血清具有美洛西林鈉針劑抗原反應(yīng)特性。

表1 76份血樣檢測(cè)結(jié)果中陽(yáng)性結(jié)果的樣品號(hào)

2.6 樣品檢測(cè)結(jié)果

樣品1至50號(hào)為住院患者的血液標(biāo)本，51至76號(hào)為健康獻(xiàn)血員的血液標(biāo)本。在陽(yáng)性血液中，有3例住院患者正在使用美洛西林鈉針劑，1例正在使用頭孢硫脒針劑，1例正在使用左氧氟沙星針劑，3例未使用過抗生素，還有1例為用藥史不詳?shù)慕】但I(xiàn)血者。在陰性血液中，有7例住院患者正在使用美洛西林鈉針劑，8例正在使用其他β-內(nèi)酰胺類抗生素。

3 討論

當(dāng)美洛西林針劑中的半抗原物質(zhì)被紅細(xì)胞吸附后成為全抗原，這種抗原顆?？杀幌鄳?yīng)抗體橋連形成較大的團(tuán)塊，在微柱凝膠中非特異性IgG作用下變成更大的團(tuán)塊，以致不能通過凝膠柱中微小孔隙，從而停留于凝膠柱上端，表現(xiàn)為陽(yáng)性結(jié)果。相反，被檢血清中如果沒有相應(yīng)的抗體，紅細(xì)胞就會(huì)在離心力的作用下穿過凝膠柱，從而沉積于凝膠柱底部，表現(xiàn)為陰性結(jié)果。當(dāng)藥敏化的紅細(xì)胞和相應(yīng)抗體不是以最佳比例結(jié)合時(shí)，團(tuán)塊可分布在凝膠柱中間，呈現(xiàn)弱陽(yáng)性。本試驗(yàn)中，有幾根凝膠柱出現(xiàn)上部和下部都有紅細(xì)胞群的現(xiàn)象。這可能是因?yàn)樗每瞻准t細(xì)胞來自多份血液，有些來源的紅細(xì)胞不易被美洛西林鈉針劑中半抗原物質(zhì)致敏，因此不能與待檢血液中的相關(guān)抗體有效結(jié)合，最終在離心力作用下沉于凝膠底部。相反，另一部分被較好致敏的紅細(xì)胞則停留在凝膠柱上部。但也不排除是待檢血液中相應(yīng)抗體滴度差別所致。

美洛西林皮膚過敏試驗(yàn)主要是檢測(cè)美洛西林IgE抗體，但美洛西林IgE抗體反應(yīng)陰性時(shí)，美洛西林IgM和（或）IgG仍可能是陽(yáng)性。本研究的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，在接受美洛西林治療的10例患者中（皮膚過敏試驗(yàn)均陰性），有3例呈IgM和（或）IgG抗體陽(yáng)性。因此有必要在美洛西林皮膚過敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)上增加人血清美洛西林IgM和（或）IgG抗體的篩查。微柱凝膠免疫法方法簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定，可操作性強(qiáng)，適用于臨床檢驗(yàn)工作。

[1]謝作聽，錢林利，陶志華，等.血清青霉素IgM和IgG抗體檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，29（6）：527-528.

[2]渾守勇，劉明霞，王玉芝.微柱凝膠技術(shù)在紅細(xì)胞不規(guī)則抗體篩選中的應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，21（1）：37-38.