L-精氨酸助溶菌酶復(fù)性過程動(dòng)力學(xué)研究

隨著基因工程領(lǐng)域的研究和發(fā)展，外源蛋白在大腸桿菌(E.coli)內(nèi)的克隆與表達(dá)已不再困難，通過細(xì)胞培養(yǎng)大量生產(chǎn)對(duì)人類有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)已成為可能。重組蛋白在宿主系統(tǒng)中高水平表達(dá)時(shí)，無論是原核表達(dá)體系，還是真核表達(dá)體系甚至高等真核表達(dá)體系，都容易形成沒有生物活性的包涵體，這主要是因?yàn)樵谥亟M蛋白的大量表達(dá)過程中，缺乏某些蛋白質(zhì)正確折疊所需要的酶和分子伴侶等，或因環(huán)境不適無法形成正確的次級(jí)鍵等[1]。從包涵體中獲得有活性的蛋白，必須進(jìn)行體外復(fù)性。蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)對(duì)于重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義，其中稀釋復(fù)性是一種最常見的蛋白質(zhì)復(fù)性方法。

實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)復(fù)性首先需要提供能使蛋白質(zhì)以能量最低狀態(tài)存在的溶液環(huán)境，其次在操作過程中需抑制蛋白質(zhì)聚集體的生成[2]。蛋白質(zhì)折疊過程中存在兩種疏水作用，即分子內(nèi)和分子間疏水作用。前者促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊成天然活性態(tài)，而后者導(dǎo)致變性蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆聚集和沉淀[3]。稀釋復(fù)性過程中往往由于聚集體的生成而嚴(yán)重影響復(fù)性收率。抑制蛋白質(zhì)肽鏈之間的聚集作用、提高變性蛋白質(zhì)的復(fù)性收率成為當(dāng)前蛋白質(zhì)復(fù)性研究的焦點(diǎn)。為了抑制變性蛋白質(zhì)分子間的疏水作用、提高蛋白質(zhì)復(fù)性收率，體外復(fù)性時(shí)添加輔助因子是其有效方法之一[4]。

L-精氨酸(L-Arginine，簡(jiǎn)稱L-Arg)具有成本低廉、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)某些蛋白質(zhì)的復(fù)性有很好的促進(jìn)作用[5，6]，特別是對(duì)一些含二硫鍵的變性蛋白[7]或某些重組蛋白的體外復(fù)性[8，9]，添加L-精氨酸能很好地提高其蛋白復(fù)性收率[7]。但是，L-精氨酸促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性過程特性的分析和研究很少[6，7，10]，特別是未見其復(fù)性過程動(dòng)力學(xué)模型的研究報(bào)道。

作者利用變性蛋白質(zhì)復(fù)性研究中提出的復(fù)性和聚集競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)機(jī)制[11]，以溶菌酶為模型蛋白，研究了L-精氨酸助溶菌酶復(fù)性的最佳條件和表觀動(dòng)力學(xué)，并討論L-精氨酸助復(fù)性的可能機(jī)理，為下一步基因工程重組蛋白的復(fù)性研究打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑

溶菌酶，碘乙酸 (Sigma,USA),二硫蘇糖醇(DTT)，氧化型谷胱甘肽(GSSG)，還原型谷胱甘肽(GSH)，L-精氨酸，三羥基氨基甲烷(Tris)，尿素(進(jìn)口分裝，上海源聚生物科技有限公司)。

變性緩沖溶液為pH值8.6的0.1 mol·L-1Tris-HCl,含8 mol·L-1尿素、30 mmol·L-1DTT和1 mmol·L-1EDTA。

基礎(chǔ)復(fù)性緩沖溶液為pH值8.2的0.1 mol·L-1Tris-HCl,含0.4 mmol·L-1GSSG、4 mmol·L-1GSH和1.0 mmol·L-1EDTA。用該緩沖溶液配制不同濃度的L-Arg復(fù)性緩沖溶液，備用。

1.2 方法

1.2.1 溶菌酶的變性

稱取天然溶菌酶固體溶解于變性緩沖溶液中，濃度為10 mg·mL-1,在37℃下保溫4 h使溶菌酶徹底變性，置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 溶菌酶的復(fù)性

取一定量的變性溶菌酶與復(fù)性緩沖溶液混合至總體積為3 mL，在37℃下保溫24 h，測(cè)定酶活性。

1.2.3 復(fù)性動(dòng)力學(xué)測(cè)定

取所需的變性溶菌酶原液置于250 mL錐形瓶，加入所需的復(fù)性緩沖溶液至總體積為100 mL,混合后置于恒溫水浴搖床(37℃、60 r·min-1)進(jìn)行復(fù)性。復(fù)性過程中定時(shí)取樣，每次取樣量為1 mL,加入100 μL 0.5 mol·L-1碘乙酸作為反應(yīng)終止劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)一測(cè)定樣品活性。

1.2.4 溶菌酶活性測(cè)定[11]

以微球菌(Micrococcuoslysodeikticus)為底物，用pH值6.2的0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液配制微球菌溶液，調(diào)節(jié)其在450 nm處的吸光度為1.3，然后取2.5 mL菌液，加入500 μL溶菌酶溶液，測(cè)定反應(yīng)液在450 nm處吸光度的變化，通過吸光度的降低速率來計(jì)算溶菌酶的活性。

用復(fù)性收率(Yield)表征復(fù)性效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-Arg助溶菌酶復(fù)性的最佳條件

2.1.1 溶菌酶濃度的選擇

稀釋復(fù)性過程中的聚集反應(yīng)是導(dǎo)致復(fù)性收率低的首要原因，為減少聚集并促進(jìn)折疊反應(yīng)和提高復(fù)性收率，通常將蛋白質(zhì)稀釋到很低的濃度(10～50 μg·mL-1)[8]，但同時(shí)也限制了它的大規(guī)模應(yīng)用。如復(fù)性過程中添加L-Arg，溶菌酶可以在100～500 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)保持較高的復(fù)性收率。

在復(fù)性緩沖溶液中分別添加0 mol·L-1、0.4 mol·L-1、0.6 mol·L-1和0.8 mol·L-1L-Arg，溶菌酶濃度對(duì)溶菌酶復(fù)性收率的影響見圖1。

圖1 溶菌酶濃度對(duì)溶菌酶復(fù)性收率的影響

從圖1可以看出，隨著溶菌酶濃度的增大，溶菌酶復(fù)性收率呈下降趨勢(shì)；加入L-Arg后，復(fù)性收率明顯提高。同時(shí)，添加L-Arg后，溶菌酶濃度從100 μg·mL-1升至200 μg·mL-1時(shí)，復(fù)性收率略有下降；但溶菌酶濃度升至250 μg·mL-1后，復(fù)性收率急劇下降。在溶菌酶濃度為200 μg·mL-1時(shí)，添加0.8 mol·L-1L-Arg時(shí)，復(fù)性收率可達(dá)80%以上；添加0.6 mol·L-1L-Arg時(shí)，復(fù)性收率也可達(dá)80%；當(dāng)溶菌酶濃度超過300 μg·mL-1時(shí)，復(fù)性收率均低于50%。因此，確定最佳溶菌酶濃度為200～300 μg·mL-1。

2.1.2 L-Arg濃度的選擇

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不添加L-Arg，溶菌酶濃度即使為100 μg·mL-1，復(fù)性體系也會(huì)出現(xiàn)大量沉淀，復(fù)性收率也很低(低于50%)；添加0.4 mol·L-1L-Arg，溶菌酶濃度為200 μg·mL-1開始出現(xiàn)沉淀；添加0.6 mol·L-1L-Arg，溶菌酶濃度為300 μg·mL-1開始出現(xiàn)沉淀；添加0.8 mol·L-1L-Arg,溶菌酶濃度為500 μg·mL-1時(shí)，復(fù)性體系也沒有出現(xiàn)沉淀。可見添加L-Arg可以在一定程度上抑制復(fù)性過程中蛋白聚集。

L-Arg濃度對(duì)溶菌酶復(fù)性收率的影響見圖2。

圖2 L-Arg濃度對(duì)溶菌酶復(fù)性收率的影響

從圖2可以看出，隨著L-Arg濃度的增大，復(fù)性收率先升高后降低，當(dāng)L-Arg濃度為0.8 mol·L-1時(shí)，復(fù)性收率最高。因此，確定L-Arg的最佳濃度為0.8 mol·L-1。

2.2 L-Arg助溶菌酶復(fù)性過程動(dòng)力學(xué)研究

2.2.1 動(dòng)力學(xué)模型

變性蛋白質(zhì)的復(fù)性動(dòng)力學(xué)通常采用基礎(chǔ)三態(tài)模型描述，即：

其中：U為變性蛋白；I為中間態(tài)蛋白；N為天然態(tài)蛋白；A為聚集態(tài)蛋白。對(duì)變性溶菌酶，由U生成I的過程為快速反應(yīng)過程，在10～200 ms內(nèi)完成[11]，故基礎(chǔ)三態(tài)模型描述的復(fù)性反應(yīng)可進(jìn)一步簡(jiǎn)化為從I生成N和A的平行反應(yīng)。復(fù)性動(dòng)力學(xué)方程為：

(1)

(2)

初始條件為：

t=0，cI=cU,0

(3)

式中:kN為復(fù)性速率常數(shù)；kA為聚集體生成速率常數(shù)；n為聚集體生成反應(yīng)級(jí)數(shù)；cI為中間態(tài)蛋白濃度；cU,0為變性蛋白的初始濃度;cN為天然態(tài)蛋白濃度。

Maachupalli-Reddy等[11]在對(duì)變性溶菌酶的稀釋復(fù)性研究中發(fā)現(xiàn)，在溶菌酶濃度為0.1～0.6 mg·mL-1范圍內(nèi)，聚集體的生成符合三級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，即n=3。因此，積分式(1)～(3),得到：

(4)

其中：

(5)

(6)

在溶菌酶濃度為200 μg·mL-1、復(fù)性溶液pH值為8.2、添加0.8 mol· L-1L-Arg條件下，研究溶菌酶的復(fù)性動(dòng)力學(xué)，結(jié)果見圖3。

圖3 L-Arg助溶菌酶復(fù)性動(dòng)力學(xué)曲線

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與式(4)可以較好地?cái)M合，這也與Maachupalli-Reddy等[11]的報(bào)道結(jié)果一致。擬合得到的速率常數(shù)kN=0.0345 min-1、kA=0.265 mL2·mg-2·min-1。與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的速率常數(shù)(kN=0.045 min-1、kA=0.728 mL2·mg-2·min-1)對(duì)比，添加0.8 mol·L-1L-Arg得到的復(fù)性速率常數(shù)kN略有減小，但聚集體生成速率常數(shù)kA卻降低60%多。這也說明添加L-Arg有明顯抑制復(fù)性蛋白聚集沉淀的作用。

2.2.2 溶菌酶濃度對(duì)復(fù)性動(dòng)力學(xué)的影響

在復(fù)性溶液pH 值為8.2、添加0.8 mol· L-1L-Arg條件下，考察溶菌酶濃度對(duì)復(fù)性動(dòng)力學(xué)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 添加0.8 mol·L-1L-Arg時(shí)，溶菌酶濃度對(duì)復(fù)性動(dòng)力學(xué)的影響

實(shí)驗(yàn)表明，溶菌酶濃度在100～500 μg·mL-1時(shí)，添加0.8 mol· L-1L-Arg助溶菌酶復(fù)性，其復(fù)性動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也與式(4)較好地?cái)M合。

在復(fù)性溶液pH值為8.2、添加 0.8 mol· L-1L-Arg條件下，溶菌酶復(fù)性速率常數(shù)kN、聚集體生成速率常數(shù)kA及復(fù)性收率Yield見表1。

從表1可以看出，在其它復(fù)性條件相同的情況下，隨著溶菌酶濃度的增大，復(fù)性速率常數(shù)kN不斷下降、蛋白復(fù)性收率也不斷下降、聚集體生成速率常數(shù)kA逐步增大。這意味著隨著溶菌酶濃度的增大，復(fù)性速率是逐漸降低的，即在復(fù)性的初始階段中間態(tài)蛋白生成天然態(tài)蛋白的反應(yīng)速度下降，造成過多的中間態(tài)蛋白生成聚集態(tài)蛋白，使得聚集體生成速率常數(shù)kA增大，聚集態(tài)蛋白量相應(yīng)增大，復(fù)性收率也就下降。由此可見，要保持高的復(fù)性收率，溶菌酶濃度不能太高，最好不要超過300 μg·mL-1，這也與2.1.1的結(jié)果相一致。

表1 溶菌酶濃度對(duì)0.8 mol·L-1 L-Arg助溶菌酶復(fù)性的 復(fù)性速率常數(shù)、聚集體生成速率常數(shù)、復(fù)性收率的影響

2.2.3 L-Arg濃度對(duì)復(fù)性動(dòng)力學(xué)的影響

在溶菌酶濃度為200 μg·mL-1的條件下，考察L-Arg濃度對(duì)復(fù)性動(dòng)力學(xué)的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 L-Arg濃度對(duì)溶菌酶復(fù)性動(dòng)力學(xué)的影響

實(shí)驗(yàn)表明，溶菌酶濃度為200 μg·mL-1時(shí)，添加0～1.0 mol·L-1L-Arg助溶菌酶復(fù)性，其復(fù)性動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也與式(4)能較好地?cái)M合。

在溶菌酶濃度為200 μg·mL-1條件下添加不同濃度L-Arg,溶菌酶復(fù)性速率常數(shù)kN、聚集體生成速率常數(shù)kA及復(fù)性收率Yield見表2。

表2 L-Arg濃度對(duì)溶菌酶復(fù)性的復(fù)性速率常數(shù)、聚集體生成速率常數(shù)、復(fù)性收率的影響

從表2可以看出,在溶菌酶濃度不變的情況下,隨著L-Arg濃度的增大,溶菌酶復(fù)性速率常數(shù)kN變化不大,但聚集體生成速率常數(shù)kA卻顯著減小。這說明L-Arg的作用主要是抑制蛋白聚集沉淀，而且L-Arg對(duì)蛋白聚集體的抑制作用隨著其濃度的增大而不斷增強(qiáng)。同時(shí)，隨著L-Arg濃度的增加，溶菌酶復(fù)性速率常數(shù)kN先是不斷增加，在0.6～0.8 mol·L-1L-Arg范圍內(nèi)相對(duì)較高，繼續(xù)增加L-Arg濃度，復(fù)性速率常數(shù)kN卻不增反降。這表明L-Arg既可以抑制蛋白分子之間的疏水作用，又可以抑制分子內(nèi)的疏水相互作用，前者抑制蛋白聚集沉淀，后者卻抑制蛋白復(fù)性，在添加L-Arg濃度低于0.8 mol·L-1時(shí)，L-Arg對(duì)蛋白分子間疏水作用力的抑制作用強(qiáng)于對(duì)分子內(nèi)疏水作用力，表現(xiàn)為聚集體生成速率常數(shù)kA的降低和溶菌酶復(fù)性速率常數(shù)kN的上升，且kA的降低幅度遠(yuǎn)大于kN的上升幅度，復(fù)性收率Yield不斷上升；而L-Arg濃度高于0.8 mol·L-1時(shí)，對(duì)蛋白分子間疏水作用力的抑制作用卻弱于對(duì)分子內(nèi)疏水作用力，表現(xiàn)為kA和kN均降低，但kN降低幅度更大，復(fù)性收率Yield下降。因此，添加L-Arg助溶菌酶復(fù)性，L-Arg的最適濃度為0.8 mol·L-1，這與2.1.2結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

利用L-Arg助溶菌酶復(fù)性時(shí)，其最佳的復(fù)性條件如下：溶菌酶濃度為200～300 μg·mL-1，添加的L-Arg濃度為0.8 mol·L-1。蛋白質(zhì)的復(fù)性和聚集反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)三態(tài)動(dòng)力學(xué)模型能較好地描述L-Arg助溶菌酶復(fù)性過程。利用該模型分析溶菌酶濃度和添加的L-Arg濃度對(duì)復(fù)性速率常數(shù)kN、聚集體生成速率常數(shù)kA以及復(fù)性收率Yield的影響，獲得了有價(jià)值的結(jié)果。添加L-Arg助蛋白復(fù)性，L-Arg主要是通過抑制蛋白分子間的疏水作用來抑制復(fù)性過程蛋白聚集沉淀，從而達(dá)到提高復(fù)性收率的效果。

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