李 琳 ，雷閩湘 ，徐寒松，劉澤灝

（1.長沙市一醫(yī)院內分泌代謝科，湖南 長沙410008;2.中南大學湘雅醫(yī)院內分泌代謝科，湖南長沙410078）

血管內皮祖細胞是成熟血管內皮細胞的前體細胞，屬于干細胞群體，既可自我更新，又能定向分化為成熟的內皮細胞。已有研究表明2型糖尿病患者的內皮祖細胞數量減少、功能受損[1-2]。我們知道2型糖尿病患者由于胰島素抵抗，許多都存在高胰島素血癥。而細胞凋亡是細胞數目減少的機制之一。本文分別用不同濃度的胰島素對體外培養(yǎng)的健康人的外周血內皮祖細胞進行干預，以觀察其對內皮祖細胞凋亡的影響，從而用于探討糖尿病患者內皮祖細胞數量減少的機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

正常成年人(年齡25～30歲)外周血液9份，其中男性血液標本5份，女性血液標本4份。所有供血者均排除吸煙、近期外傷、手術史、皮膚潰瘍等影響內皮祖細胞的因素。

1.2 試劑

M199培養(yǎng)基 (Hyclone公司)，VEGF,bFGF,EGF,IGF-l(Pepro Tech EC 公司)，Annexin V-FITC試劑盒(晶美生物工程有限公司)，F(xiàn)ITC-UEA-1(Sigma公司)，人淋巴細胞分離液（天津灝洋公司），注射用速效豬胰島素(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 EPCs的分離，誘導和分化

分離出健康成年人外周血單個核細胞，加入含胎牛血清、VEGF、bFGF、EGF、 IGF-1的 M199培養(yǎng)基。飽和濕度、5%CO237℃孵育箱中培養(yǎng),每4d換液一次。貼壁細胞供實驗用。

1.3.2 EPCs鑒定

上述細胞加入FITC-UEA-1和Dil-acLDL孵育洗滌后,激光共聚焦顯微鏡下觀察,FITC-UEA-1(綠光)和 Dil-acLDL(紅光)雙陽性細胞為 EPCs。

1.3.3 不同濃度的胰島素干預

內皮祖細胞培養(yǎng)第7天，更換培養(yǎng)基，成分同前，分別用不同終濃度的豬胰島 (0mU/l,20mU/l,200mU/l,2000mU/l)干預。

1.3.4 凋亡測定

將經不同濃度胰島素干預后的每組內皮祖細胞消化洗滌重懸后，先后加入Annexin-FITC和PI?；靹蚝笥谑覝乇芄夥跤?5min。

每組經過上述步驟處理得到的細胞懸液分別在熒光顯微鏡下觀察。發(fā)綠色熒光的為早期凋亡細胞，同時發(fā)綠色和紅色熒光的細胞為壞死細胞。分別對每張玻片的3個不同的視野進行計數。經過上述步驟處理得到的每管細胞懸液分別用流式細胞儀進行分析。

1.4 統(tǒng)計分析

各組數據以mean±SD表示。不同濃度胰島素干預組兩兩之間比較用t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 熒光顯微鏡下不同濃度胰島素干預24h后的檢測結果

熒光顯微鏡下計數，20mU/L胰島素干預組較對照組的凋亡率無明顯差異 (P＞0.05)，200mU/L及2000mU/L組較對照組凋亡率明顯增高 (P＜0.05)，2000m/U/L與2000mU/L組比較，凋亡率明顯增高(P＜0.05)，結果見見表 1。

表1 熒光顯微鏡下不同濃度胰島素干預24h后的檢測結果

2.2 熒光顯微鏡下2000m U/L胰島素組不同干預時間的檢測結果

由表2可見，2000mU/L胰島素干預組48h較24h的凋亡率有明顯差異(P＜0.05)。

表2 熒光顯微鏡下2000mU/L胰島素組不同干預時間的檢測結果

2.3 流式細胞儀檢測不同濃度胰島素干預24h后的檢測結果

流式細胞儀分析，20mU/L胰島素干預組較對照組的凋亡率無明顯差異 (P＞0.05)，200mU/L及2000mU/L組較對照組凋亡明顯增高 (P＜0.05)；2000mU/L與2000mU/L組比較，凋亡率明顯增高(P＜0.05)，結果見表 3。

2.4 流式細胞儀檢測2000m U/L胰島素組不同干預時間的結果

由表4可見，2000mU/L胰島素干預組48h較24h的凋亡率有明顯差異(P＜0.05)。

表3 流式細胞儀檢測不同濃度胰島素干預24h后的檢測結果

表4 流式細胞儀檢測2000m U/L胰島素不同干預時間的檢測結果

3 討論

正常人空腹胰島素水平波動在5～25 mU/L，餐后胰島素峰值是空腹的5～10倍，持續(xù)時間不長(2～3 h)。在2型糖尿病患者中由于胰島素抵抗的存在，許多患者存在高胰島素血癥。因此我們的實驗用20mU/L、200mU/L、2000mU/L胰島素誘導內皮祖細胞的凋亡，結果發(fā)現(xiàn)在24 h內200mU/L、2000mU/L均可以增加內皮祖細胞的凋亡率，并且高濃度胰島素(2000mU/L)對內皮祖細胞凋亡的這種影響呈時間依賴性，但是24 h內20mU/L胰島素與對照組的凋亡率的差異在統(tǒng)計學上無顯著性。這提示生理濃度胰島素不會增加內皮祖細胞的凋亡，長時間(即超過正常餐后胰島素高峰持續(xù)時間)的高胰島素濃度將增加內皮祖細胞的凋亡。2型糖尿病患者由于長期在高血糖及高胰島素血癥狀態(tài)下,內皮祖細胞的凋亡增加，分化增殖受到抑制，導致2型糖尿病患者的內皮祖細胞數量較正常人減少，這也正與我們過去的研究[3]相符。而且在達到2型糖尿病診斷標準前的正常葡萄糖耐量階段和糖耐量減低階段均可長期存在高空腹胰島素血癥[4]。從我們的體外胰島素干預培養(yǎng)的結果推測2型糖尿病在正常葡萄糖耐量階段和糖耐量減低階段就可能已經存在了內皮祖細胞的數量減少，而有研究表明內皮祖細胞數量減少是糖尿病血管并發(fā)癥的機制之一[5]，因此在2型糖尿病的正常葡萄糖耐量階段和糖耐量減低階段可能就已經存在了內皮功能受損，這提示我們在2型糖尿病的正常葡萄糖耐量階段和糖耐量減低階段就應該進行增強胰島素敏感性的治療，以預防血管并發(fā)癥的發(fā)生。

[1]Loomans CJ,de Koning EJ,Staal FJ,Rookmaaker MB,Verseyden C,de Boer HC,Verhaar MC,Braam B,Rabelink TJ,van Zonneveld AJ.Endothelial progenitor cell dysfunction:a novel concept in the pathogenesis of vascular complications of type 1 diabetes[J].Diabetes,2004,53(1):195-199.

[2]Tepper OM,Galiano RD,Capla JM,et al.Human endothelial progenitor cells from type II diabetics exhibit impaired proliferation,adhesion,and incorporation into vascular structures[J].Circulation,2002,106(22):2781-2786.

[3]王愛民,雷閩湘,劉澤灝.2型糖尿病外周血內皮祖細胞的誘導分化及影響因素的研究 [J].中國糖尿病雜志,2006,14(3):188-191.

[4]Groop LC.Insulin resistance:the fundamental trigger of type 2 diabetes[J].Obesity Metabolism,1999,suppl1:S1-7.

[5]Fadini GP,Miorin M,Facco M,Bonamic S,Baesso I,et al.Circulating endothelial progenitor cells are reduced in peripheral vascular complications of type 2 diabetes mellitus[J].J Am Coll Cardiol,2005,45(9):1458-1460.