徐國興 李 瓊 謝茂松 郭 健 王婷婷 胡建章

視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)與純化

徐國興 李 瓊 謝茂松 郭 健 王婷婷 胡建章

福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院,福建省眼科研究所

目的：探討人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的體外分離和選擇性培養(yǎng)方法。方法：將人視網(wǎng)膜通過剪碎、勻漿、過篩、膠原酶消化處理后，結(jié)合密度梯度離心和物理刮除等分離方法獲得較純的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞，接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，并采用含內(nèi)皮細胞生長因子和肝素的培養(yǎng)基促進內(nèi)皮細胞貼壁生長，觀察細胞生長狀況，并應用免疫組化方法進行鑒定。結(jié)果：培養(yǎng)的細胞成典型的鋪路石樣生長，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色為陽性，細胞純度達98%以上。結(jié)論：本實驗方法簡單易行，培養(yǎng)出的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞純度高、生長狀態(tài)良好，并可穩(wěn)定傳代，為視網(wǎng)膜血管疾病的基礎(chǔ)研究提供有效的模型建立方法。

視網(wǎng)膜 微血管 內(nèi)皮細胞 細胞培養(yǎng)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜疾病均與視網(wǎng)膜血管病理性改變密切相關(guān)。隨著對視網(wǎng)膜血管性疾病的研究深入，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞是視網(wǎng)膜血管病變過程中的關(guān)鍵細胞。通過體外分離培養(yǎng)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞獲得大量完整、純度高的內(nèi)皮細胞，從而對其進行形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能和病理變化等方面的觀察，為視網(wǎng)膜血管性疾病研究提供體外模型。本實驗以人視網(wǎng)膜為材料，探索簡便、有效的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)與純化方法?，F(xiàn)報告如下：

1 材料與方法

1.1 材料

0.1%Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）、胎牛血清(Gibco公司，美國) 、DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司，美國)、含0.02%EDTA的0.25%胰酶（Gibco公司，美國）、纖維連接蛋白（Sigma公司，美國）、內(nèi)皮細胞生長因子ECGF(Sigma公司，美國) 、Percoll分離液（Gibco公司，美國）、肝素（Sigma公司，美國）、PBS（Sigma公司，美國）、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、眼科器械、勻漿器、吸管、離心管、細胞篩、第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），完全培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)液+15%FBS+90μg/mL肝素+0.1μg/L的ECGF，培養(yǎng)瓶：培養(yǎng)前1天用10μg/cm2纖維連接蛋白包被。

1.2 方法

1.2.1人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的分離與原代培養(yǎng)

原代細胞培養(yǎng)使用的眼球為角膜移植后殘留的供體眼球。無菌操作，浸入酒精中消毒2遍，轉(zhuǎn)入DMEM培養(yǎng)液中。距角膜緣后3mm穿刺，剪去眼前節(jié)，娩出玻璃體，吸取DMEM培養(yǎng)液將視網(wǎng)膜神經(jīng)層吹起吸出，將視網(wǎng)膜置于DMEM培養(yǎng)液中洗滌2~3次，去除色素組織并夾出較大的血管，再將視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿中剪碎后勻漿，將勻漿液過兩層細胞標準篩（先過220μm，后過86μm），將第2層細胞篩翻轉(zhuǎn)后用DMEM培養(yǎng)液充分沖洗，收集洗脫液后離心（1000r/min，10min），棄上清后加入3倍體積的0.1%膠原酶吹打均勻后移入離心管中在37℃200r/min搖床上消化60min，離心（1000r/min，10min），棄上清，用DMEM培養(yǎng)液懸浮細胞，將Percoll分離液加入DMEM培養(yǎng)液中，以20000r/min離心30min制備連續(xù)密度梯度，吸取上述細胞懸液2mL小心加入25mL離心管頂層分離介質(zhì)面上，離心（1000r/min，10min），用注射器針頭吸取所需的細胞層(第2層)，以添加ECGF的完全培養(yǎng)液懸浮細胞，接種于包被有10μg/cm2纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細胞。24 h內(nèi)嚴禁移動培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)2d后首次換液，以后每2d換液1次，2天換液1次，保持ECGF的濃度。換液前相差倒置顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞，標記雜細胞位置，用細胞刮去除雜細胞。

1.2.2人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的傳代培養(yǎng)

當原代細胞融合80％以上后，開始傳代培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗1～2次；加入0.25%胰蛋白酶與0.02 EDTA混合消化液，室溫下消化，在相差顯微鏡下觀察，當鋪路石樣細胞開始變圓收縮，細胞間隙變大時，倒出消化液；以含15%FBS的完全培養(yǎng)液終止消化，反復吹打瓶壁上細胞，脫壁后形成細胞懸液，按1：2的比例進行傳代，接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中。傳代后每2～3 d換液1次。

1.2.3人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的鑒定

(1)形態(tài)學：在相差倒置顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞形態(tài)特征、生長特性及與微血管碎片的距離，并運用目鏡網(wǎng)格器計數(shù)法觀察記錄培養(yǎng)瓶中混雜的其他細胞，每瓶選擇3個視野，實驗各重復3次。(2)Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化檢查：以0.5×105/·L 的細胞密度接種2mL細胞懸液接種于預先置有20mm×20mm蓋玻片的六孔板中，并置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h至細胞爬滿玻片后取出，PBS漂洗細胞2次，以4%多聚甲醛固定20min；PBS沖洗3次，免疫細胞化學染色二步法檢測Ⅷ因子相關(guān)抗原。陰性對照：一抗用PBS代替。顯微鏡下觀察、采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞形態(tài)學特點

經(jīng)過分離純化后接種于培養(yǎng)瓶的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮中混雜有許多雜細胞，如紅細胞、膠質(zhì)細胞、周細胞等。24h后可見有血管內(nèi)皮細胞貼壁，呈扁平梭形；5~7d細胞分裂、克隆樣生長，形成細胞集落，呈類圓形、多邊形形狀；12d左右細胞融合呈鋪路石樣，單層生長，鋪滿瓶底，可見接觸抑制現(xiàn)象。

2.2 視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞免疫組織化學鑒定

視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞經(jīng)第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體染色，即胞漿中有棕色著色，98%以上細胞呈陽性染色。陰性對照組無著色。

3 討論

視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的分離和培養(yǎng)在認識視網(wǎng)膜血管性疾病的病理生理等過程中發(fā)揮了重要作用。視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮的培養(yǎng)由于取材困難，培養(yǎng)的細胞不易純化，一直是視網(wǎng)膜細胞培養(yǎng)中的難點。

3.1 視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的分離

取材過程中，要采用新鮮的人眼，并保證操作過程絕對無菌，盡量去除視網(wǎng)膜上的視網(wǎng)膜色素上皮細胞，并夾除可見的大血管。視網(wǎng)膜微血管段的分離和內(nèi)皮細胞的獲取、純化作為視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵步驟，對微血管段的分離程度要求較高，因此我們采用剪碎勻漿分離法獲得視網(wǎng)膜微血管段。在勻漿器的選擇上，注意玻璃杵與管壁應有一定的間隙，勻漿物與勻漿液的比例控制在1:1左右，研磨次數(shù)不宜太多，以免微血管段過度破碎。將組織分離后得到的勻漿液進行過濾和離心。用220μm及86μm的細胞篩可分別篩去未分離的血管段組織和一些較大的細胞以及血細胞等比血管內(nèi)皮細胞小的細胞及一些碎片，得到較為純凈的微血管段。我們采用0.1g/L膠原酶在37℃200r/min搖床上消化60min，能夠?qū)⒁暰W(wǎng)膜間質(zhì)消化獲得單細胞懸液并保持較好的細胞活性。

3.2 視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的貼壁和純化

我們使用纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶能夠有效地促進內(nèi)皮細胞貼壁，同時抑制其他混雜細胞貼壁生長[1]。在培養(yǎng)液的選擇上，我們配制了添加有15%FBS、90μg/ml肝素、0.1μg/L ECGF的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，形成只利于內(nèi)皮細胞生長的選擇性培養(yǎng)環(huán)境，使內(nèi)皮細胞進一步得到純化[2]。周細胞與內(nèi)皮細胞的分離是純化技術(shù)的難點，我們采用密度梯度離心和物理刮除等方法去除周細胞。Percol1分離液是一種外面被聚乙酰胺吡咯烷酮包被的硅膠顆粒，它無毒、無刺激性，對細胞無吸附作用，產(chǎn)生的滲透壓很小，因此在全部密度范圍保持等張。Percoll在離心過程中會自然形成密度梯度，內(nèi)皮細胞和周細胞因其密度不同而在分離液中處于不同的層面。從而將提高內(nèi)皮細胞純度[3]。原代培養(yǎng)3~5d后，一些混雜的細胞常常分區(qū)成片的生長，可以利用內(nèi)皮細胞呈獨特的鋪路石樣形態(tài)單層生長，而周細胞呈長梭狀的可重疊生長，在培養(yǎng)瓶底部標記后用細胞刮匙刮除雜細胞，從而獲得較純的內(nèi)皮細胞[4]。此外，在傳代過程中，采用含0.02%EDTA的0.25%胰酶可使周細胞較內(nèi)皮細胞更先松動，利用該特點可以除去部分周細胞。

綜上所述，我們認為使用纖維連接蛋白包被培養(yǎng)瓶及添加肝素和內(nèi)皮細胞生長因子的培養(yǎng)基，并結(jié)合物理刮除、密度梯度離心法等可以成功獲得高純度的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞，為體外研究視網(wǎng)膜血管相關(guān)疾病奠定了基礎(chǔ)。

[1] Schor AM,Schor SL.The isolation and colture of endothelial cells and pericytes from the bovine retinal microvasculature: a comparative study with large vessel vascular cells[J]. Microvase Res,1986,32(1):21-38.

[2] Lin C,Mctough R,Aswad B,et al.Hypoxin induces HIF-1,alpha and VEGF expression in chondrosarcoma cells and chondrocytes[J]. J Orthop Res, 2004, 22(4): 1175-1181.

[3] ZhouB,Oka JA,SinghA,et a1.Purificationand subunit characterization of the rat liver endocytic hyaluronan receptor[J]. J Biol Chem,1999,26,274(48):33831-33834．

[4] Bowman PD,Betz AL,Goldstein GW. Primary culture of microvascular endothelial cells from bovine retina:selective growth using fibronectin coated substrate and plasma derived serum[J]. In Vitro,1982,18:626-632.

1.國家衛(wèi)生部科研基金課題（基金編號：WKJ2008-2-61）；2.福建醫(yī)科大學教授發(fā)展基金課題(基金編號：2006-js033);3.國家十一五重大科研項目(基金編號：2006BAHO2A25)。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。