薛 美，王海偉，于 力

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/大動(dòng)物病研究室，黑龍江哈爾濱150001)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)的口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄動(dòng)物傳染病。病毒基因組為單股正鏈RNA，全長約為8 500 nt，其ORF編碼一個(gè)大的多聚蛋白，由前導(dǎo)蛋白(Lpro)，P1結(jié)構(gòu)蛋白，P2和P3非結(jié)構(gòu)蛋白組成。其中Lpro是病毒基因組翻譯的第一個(gè)蛋白，又稱前導(dǎo)蛋白，其編碼區(qū)存在兩個(gè)AUG起始密碼子，分別編碼 Labpro(大)和 Lbpro(小)[1]。Labpro與 Lbpro間隔84個(gè)核苷酸，第一個(gè)AUG的使用頻率低，第2個(gè)AUG的使用頻率高。Lpro有兩個(gè)已知的功能：首先，它能從延伸的多聚蛋白的N端自身催化分離，這種活性使得衣殼前體蛋白P1的N端豆蔻酰化，從而完成病毒衣殼的正確組裝。其次，它能剪切真核翻譯起始因子eIF-4F的p220亞基(eIF-4G)，從而抑制帽依賴型的宿主細(xì)胞的蛋白合成[2]。小RNA病毒合成的RNA無帽化結(jié)構(gòu)，因此L蛋白阻礙宿主細(xì)胞蛋白合成的功能不影響病毒的進(jìn)一步翻譯。

Lpro是重要的毒力決定因子，根據(jù)這一特點(diǎn)，Piccone等以A12病毒為骨架構(gòu)建缺失Lpro編碼區(qū)的感染性克隆，拯救的Lpro缺失病毒對(duì)牛和豬不致病，而且感染動(dòng)物沒有傳染性，可望用作基因缺失弱毒疫苗[2-3]。國內(nèi)鄒興啟等構(gòu)建了豬O型FMDV OZK/93株Lpro編碼基因缺失的感染性克隆，并對(duì)其進(jìn)行基因修飾，探討其作為疫苗載體的可行性[4]。FMDV的Lpro編碼基因在不同血清型之間是高度變異的[5]，對(duì)于Asia1型FMDV Lpro功能的研究尚未見報(bào)道。

本研究首次構(gòu)建了缺失毒力因子Lpro的Asia 1型FMDV的感染性克隆，為深入研究FMDV Lpro的功能建立了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 感染性克隆重組質(zhì)粒和細(xì)胞系 Asia1型FMDV全長感染性cDNA克隆(pAsi)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[6]；乳倉鼠腎細(xì)胞BHK-21由本研究室保存，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM。

1.2 主要試劑 PrimeSTAR DNA聚合酶，各種限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司。T4 DNA連接酶購自NEB公司，體外轉(zhuǎn)錄采用Promega公司的Ribo-MAXTMLarge Scale RNA Production systems-T7試劑盒。轉(zhuǎn)染試劑采用QIAGEN公司的Effenctene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒，羊抗鼠熒光二抗購自Sigma公司。針對(duì)亞洲1型FMDV的單克隆抗體(MAb)3E11由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的Asia1型FMDV全長基因組的cDNA設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，引物序列為：655U：5'-ACCCGTGCAACTTGA AACTCC-3'； DL1160L： 5'-CCGGACTGGATTGCCC GGCTCCCATCTTTCCTTGTGTCCGTG-3'； 2143L：5'-CGGCGTCCAGTCAAACAGGTG-3'； DL1155U：5'-TCTTTCACGGACACAAGGAAAGATGGGAGCCG GGCA ATCCAGTC-3'。用融合PCR方法缺失自第二個(gè)啟動(dòng)子AUG之后的Lpro編碼區(qū)。融合后片段全長為993 bp，PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 PCR產(chǎn)物純化、克隆及測序 采用試劑盒并按操作手冊(cè)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠切割純化，PCR膠回收產(chǎn)物與FMDV pAsi同時(shí)用Xba1和Nde1雙酶切，將PCR擴(kuò)增片段克隆于pAsi中，采用試劑盒提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定，由英峻生物技術(shù)公司測序。

1.5 體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染 重組質(zhì)粒以EcoRV切酶線性化，并將其純化，按RiboMAXTMLarge Scale RNA Production systems-T7試劑盒操作說明書的方法進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將體外轉(zhuǎn)錄的RNA用QIAGEN公司的Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染80%單層的BHK-21細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)病變，將細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，2 000 r/min離心10 min，取上清連續(xù)傳代7次進(jìn)行病毒擴(kuò)增。

1.6 間接免疫熒光檢測(IFA) 將轉(zhuǎn)染后收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物上清接種96孔板上的BHK-21細(xì)胞，用預(yù)冷的無水乙醇固定20 min，漂洗后洗凈殘液，加入Asia1/YS/CHA/05 特異 性 MAb 3E11(1∶200)50 μL/孔，置濕盒中1 h，用PBS洗3次，滴加羊抗鼠FITC(1∶200)，置濕盒孵育50 min，PBS洗3次，于熒光倒置顯微鏡下觀察，用Leica成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.7 一步生長曲線 在單層BHK-21細(xì)胞中，按5 TCID50/cell分別接種拯救病毒和親本病毒，37℃吸附1 h后用PBS洗去未吸附的病毒，加2%FBS維持液培養(yǎng)，在2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h和14 h的時(shí)間點(diǎn)分別收獲病毒，測定不同時(shí)間點(diǎn)收獲病毒的TCID50，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次。以病毒生長時(shí)間為橫坐標(biāo)、以病毒在不同時(shí)間點(diǎn)的TCID50平均值為縱坐標(biāo)，繪制病毒的一步生長曲線，比較拯救病毒和親本病毒在BHK-21細(xì)胞上的增殖特性和復(fù)制能力。

1.8 拯救病毒對(duì)乳鼠的毒力檢測 選用3日齡乳鼠45只，其中40只隨機(jī)分為A、B兩組。分別頸部皮下注射稀釋為0.01 TCID50、0.1 TCID50、1 TCID50、10 TCID50的病毒液200 μL，A組20只注射親本毒，B組20只注射拯救病毒，陰性對(duì)照組只注射PBS(200 μL/只)，觀察拯救病毒對(duì)乳鼠的致病性，并與親本毒進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 缺失 Lpro的 Asia1型 FMDV(rFMDV-ΔL)的拯救 用體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后72 h，細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，呈葡萄串狀分布，最后崩解成碎片。將細(xì)胞培養(yǎng)物連續(xù)傳代，CPE出現(xiàn)的時(shí)間逐漸縮短，CPE更為典型，傳至第3代時(shí)在接種病毒后10 h出現(xiàn)明顯的CPE。

2.2 拯救病毒的RT-PCR鑒定 從拯救病毒中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，用655U，2143L兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，親本病毒擴(kuò)增出約1.5 kb片段，而拯救病毒擴(kuò)增出約1 kb的片段(圖1)。結(jié)果表明，拯救病毒的Lpro基因發(fā)生了516 bp的缺失，與預(yù)期結(jié)果一致。同時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后進(jìn)行序列測定，驗(yàn)證了第二個(gè)起始密碼子AUG之后的Lpro基因的缺失。

2.3 拯救病毒間接免疫熒光檢測 以MAb 3E11作為檢測抗體，利用IFA方法，對(duì)親本病毒和拯救病毒感染的BHK-21細(xì)胞及正常BHK-21細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測，可見拯救病毒和親本病毒感染的BHK-21細(xì)胞均有特異性免疫熒光產(chǎn)生(圖2)，而正常細(xì)胞沒有出現(xiàn)熒光反應(yīng)，表明Lpro發(fā)生缺失的重組病毒被拯救。

2.4 拯救病毒的增殖特性 為研究Lpro缺失對(duì)病毒復(fù)制的影響，將拯救病毒和親本病毒稀釋成106TCID50，各取1 mL分別接種BHK-21細(xì)胞，吸附1 h后用PBS洗去未吸附的病毒。在接種后第2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h和 14 h分別收獲病毒，用Karber法計(jì)算TCID50，繪制一步生長曲線，以比較拯救病毒和親本病毒在BHK-21細(xì)胞上的增殖特性和復(fù)制能力。結(jié)果表明，Lpro缺失病毒與親本病毒相比，在BHK-21細(xì)胞上的復(fù)制能力下降(下降約10倍)，并且病毒滴度達(dá)到峰值所需的時(shí)間明顯延長(圖3)，說明缺失了 Lpro的 Asia1型FMDV在 BHK-21細(xì)胞上的復(fù)制明顯減慢。

2.5 拯救病毒對(duì)乳鼠的致病性 為研究Lpro對(duì)病毒致病力的影響，將拯救病毒在BHK-21細(xì)胞上連傳7代后，接種3日齡乳鼠，以親本毒株作為對(duì)照。結(jié)果親本毒的LD50為10-8.2，而缺失Lpro病毒的LD50下降為10-7.4。這表明，缺失Lpro的Asia1型FMDV對(duì)乳鼠的毒力有所下降。并且親本毒株死亡乳鼠出現(xiàn)癥狀十幾小時(shí)內(nèi)死亡，死亡時(shí)間均在接毒后48 h以內(nèi)；而拯救病毒接種乳鼠72 h后部分乳鼠才表現(xiàn)呼吸困難，后肢癱瘓等癥狀，從出現(xiàn)癥狀到死亡的時(shí)間明顯延長，最長可在出現(xiàn)癥狀后3 d死亡，說明病毒在乳鼠體內(nèi)的復(fù)制也明顯減慢。

3 討 論

Lpro能夠從病毒多聚蛋白的N端自我剪切下來，也能裂解真核翻譯起始因子eIF4G，阻斷宿主帽依賴性的 mRNA的翻譯[6]。為探討 Lpro在 Asia1型FMDV復(fù)制和毒力方面所起的作用，本研究在Asia1型FMDV反向遺傳操作平臺(tái)基礎(chǔ)上，利用融合PCR方法缺失前導(dǎo)蛋白酶L基因編碼區(qū)，構(gòu)建了缺失Lpro的病毒感染性克隆，并拯救出病毒。對(duì)拯救病毒進(jìn)行生物學(xué)定性發(fā)現(xiàn)，Lpro缺失病毒與親本病毒相比在BHK-21細(xì)胞上的復(fù)制能力明顯下降(下降10倍)，致BHK-21 CPE的速度明顯變慢，在BHK-21細(xì)胞上形成蝕斑的時(shí)間延長。體內(nèi)試驗(yàn)表明Lpro缺失病毒對(duì)乳鼠的毒力也有所下降(比親本毒株下降6倍)，并且致乳鼠死亡的時(shí)間也比親本毒株明顯延長，說明病毒在乳鼠體內(nèi)的增殖速度也明顯變慢。

FMDV基因組的翻譯是從相隔84個(gè)核苷酸的兩個(gè)起始AUG開始的[7]，第二個(gè)AUG為形成完整的病毒粒子所必需，并且兩個(gè)AUG之間的RNA序列對(duì)有效地起始翻譯也是必需的[2,6]。因此我們構(gòu)建感染性克隆時(shí)保留了第二個(gè)起始密碼子AUG，構(gòu)建了自第二個(gè)AUG開始缺失的感染性cDNA，將體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，拯救出了Lpro部分缺失的重組病毒。

Lpro通過自身切割從病毒多聚蛋白中游離，剪切點(diǎn)位于自身的羧基端和VP4氨基端的K201和G202之間[8]。Walter等的研究表明，將Lbpro201位K突變?yōu)镼或G均嚴(yán)重影響Lbpro的自我剪切功能，該位置的突變使得自我剪切下的Lbpro的比例從野生毒株的85.5%下降到37.5%[8]。這表明在易斷裂鍵的一側(cè)存在一個(gè)堿性殘基，Lbpro才能進(jìn)行高效的自身切割。本研究構(gòu)建的感染性cDNA缺失了自第二個(gè)AUG之后的序列，使得Lpro與VP4之間的剪切位點(diǎn)由KLK↓GAG變?yōu)镚KM↓GAG，M屬于含硫氨基酸類，而不是堿性氨基酸，因此我們推測這使Lpro不能有效地從多聚蛋白上剪切下來。Lpro從延伸的多聚蛋白的N端自身催化分離的活性能夠使衣殼前體蛋白P1的N端豆蔻?；?，從而完成病毒衣殼的正確組裝，缺失了第二個(gè)AUG之后的缺損Lpro不能如同完整的Lpro那樣高效地從延伸的多聚蛋白上自我剪切下來，影響了病毒的組裝，因此Lpro缺失病毒與親本病毒相比在BHK-21細(xì)胞上的復(fù)制能力明顯下降。由于在同樣的時(shí)間段內(nèi)形成的病毒粒子較少，表現(xiàn)為致CPE作用比親本毒株慢許多。

在體內(nèi)，Lpro缺失病毒對(duì)乳鼠的毒力有所下降，這與病毒在BHK-21細(xì)胞上形成CPE的時(shí)間延長的現(xiàn)象相一致。完整病毒粒子Lpro的存在抑制了帽依賴性的宿主蛋白的翻譯，病毒進(jìn)而利用宿主細(xì)胞的合成機(jī)制進(jìn)行生物合成。當(dāng)病毒缺失Lpro時(shí)，宿主蛋白的翻譯與病毒蛋白的翻譯發(fā)生競爭，對(duì)病毒蛋白的合成產(chǎn)生影響，因此缺失Lpro的病毒復(fù)制能力下降，表現(xiàn)為對(duì)乳鼠的毒力降低[11]。

對(duì)Lpro進(jìn)行研究，有助于對(duì)病毒復(fù)制的了解。另外，Lpro不僅能在自身羧基端和VP4的氨基端進(jìn)行切割游離自己，從而完成病毒的正確組裝，還能剪切宿主翻譯起始因子eIF-4G，抑制宿主帽依賴性的mRNA的翻譯，包括α/β IFN mRNA的翻譯，阻止或降低細(xì)胞對(duì)病毒感染的先天性免疫反應(yīng)[9]。因此，開發(fā)能夠阻斷L蛋白酶切活性的抑制劑，有可能為預(yù)防口蹄疫提供一種新的途徑。

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