李 印，鄧國華，王桂芹，楊煥良，喬傳玲，陳化蘭

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150001)

豬流感是由A型流感病毒中的豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)所引起的豬的一種急性、高度傳染性呼吸道疾病。臨床特點(diǎn)為急性發(fā)熱，傳播迅速，高發(fā)病率和低死亡率，是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一[1]。豬被認(rèn)為是人和禽流感病毒互相傳播的混合器[2-3]，對(duì)SIV流行情況的監(jiān)測與研究對(duì)于公共衛(wèi)生具有重要意義[4]。血清學(xué)調(diào)查證實(shí)，我國的豬群中一直存在H1和H3亞型SIV的流行[5-6]，不同地區(qū)和不同時(shí)間流行的病毒亞型有所差異。2009年初在墨西哥爆發(fā)的H1N1流感病毒感染，其病原就是一個(gè)具有豬源病毒基因的H1N1亞型流感病毒，它主要感染兒童和青年，致病性比人類季節(jié)性流感稍強(qiáng)，傳播能力強(qiáng)，在極短時(shí)間內(nèi)傳播到多個(gè)國家[7-9]。這提示我們加強(qiáng)豬流感的監(jiān)測是非常必要，我國對(duì)于SIV的研究還處于發(fā)展階段，主要工作是開展SIV的血清學(xué)和病原流行病學(xué)調(diào)查[10-12]，其相應(yīng)的快速監(jiān)測方法及相關(guān)診斷手段正在逐步建立和完善之中。

對(duì)于SIV感染的監(jiān)測與診斷，一個(gè)合理、方便、快捷的診斷方法就顯得非常必要和緊迫。目前為止，經(jīng)典的流感病毒的病原學(xué)以及亞型鑒定方法由于使用的多克隆抗體具有一定的亞型間交叉反應(yīng)，而單克隆抗體(MAb)因其優(yōu)良的特異性，可以較好的解決病毒間的亞型特異性和交叉反應(yīng)性的問題?；诖吮緦?shí)驗(yàn)室開展了針對(duì)H1N1亞型流感病毒特異性MAb的研究，并獲得具有良好亞型特異性的MAb細(xì)胞株，為該亞型病毒診斷以及抗原性差異性的相關(guān)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株 免疫及用于檢測MAb的HI反應(yīng)活性的H1亞型流感病毒分離株A/Swine/Guangdong/718/2001(H1N1)、 A/Swine/Jiangsu/662/2001(H1N1)、A/Swine/Guangdong/710/2001 (H1N1)、 A/Swine/Guangdong/729/2001 (H1N1)、 A/Swine/Guangdong/519/2001(H1N1)、H1亞型鴨源流感病毒參考株A/Duck/Alberta/35/76(H1N1)和H1亞型 SIV參考株A/Swine/Tennessee/26/77(H1N1)，以及用于 MAb特異性HI檢測的H1～H15亞型流感病毒參考株均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。新城疫病毒(NDV)和減蛋綜合癥病毒(EDS)病毒抗原由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所相關(guān)研究室提供。H1亞型SIV抗原由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感實(shí)驗(yàn)室豬流感組制備。

1.2 細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠SP2/0骨髓瘤細(xì)胞系及293T細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存，11日齡SPF雞胚和6周齡～8周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 質(zhì)粒與主要試劑 真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS由本實(shí)驗(yàn)室保存，A/California/04/2009 A(H1N1)病毒株的HA基因序列(FJ966082)由南京金思特公司人工合成。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT選擇培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基和PEG(MW1500)融合試劑均購自Sigma公司，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、lipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠IgG購自Southernbiotech公司。

1.4 全病毒抗原制備 將A/Swine/Guangdong/718/01種毒經(jīng)11日齡SPF雞胚尿囊腔接種擴(kuò)增，72 h收集感染雞胚的尿囊液，27 000 r/min超速離心2 h濃縮病毒，26 500 r/min蔗糖密度梯度離心(20%、40%、60%)2 h純化病毒。

1.5 MAb的制備

1.5.1 動(dòng)物免疫 稀釋純化病毒至200 μg/mL，2‰甲醛滅活后與弗氏完全佐劑等體積乳化混勻，腹腔和皮下分別注射雌性8周齡BALB/c小鼠，0.2 mL/只。以后每間隔兩周用等量弗氏不完全佐劑乳化，加強(qiáng)免疫2次，劑量同首免。融合前3 d加強(qiáng)免疫，劑量加倍。

1.5.2 血凝抑制檢測方法的建立 小鼠血清在HI實(shí)驗(yàn)前采用胰酶-高碘酸鉀方法進(jìn)行處理，其余部分同常規(guī)HI方法。

1.5.3 細(xì)胞融合和陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選 按參考文獻(xiàn)[14]的方法，將免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合后，在第3 d、7 d時(shí)分別用HAT選擇培養(yǎng)基半換液，10 d后改用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞集落長到1/2培養(yǎng)孔大小時(shí)用血凝抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測、篩選。

1.5.4 陽性細(xì)胞株的克隆純化 取陽性克隆孔內(nèi)的雜交瘤細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液稀釋至終濃度為8個(gè)～9個(gè)細(xì)胞/mL，每個(gè)培養(yǎng)孔加已稀釋的細(xì)胞懸液100 μL。待細(xì)胞集落長到1/2培養(yǎng)孔時(shí)，再次檢測，挑選單克隆陽性孔細(xì)胞進(jìn)行下一輪篩選純化，直至所有克隆化細(xì)胞生長孔為HI陽性，獲得穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

1.5.5 腹水的制備 選6周齡雌性BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟，0.5 mL/只，7 d～10 d后腹腔注射5×105個(gè)雜交瘤細(xì)胞，待小鼠腹部膨大后收集腹水，腹水4℃靜置過夜。次日3 000 r/min離心10 min收集上清，分裝保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 MAb的生物學(xué)特性鑒定

1.6.1 抗體效價(jià)的測定 以A/Swine/Guangdong/718/01病毒株配制4個(gè)單位血凝價(jià)的病毒(u)，采用HI方法測定MAb腹水及細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)。

1.6.2 抗體亞類的鑒定 采用SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類鑒定試劑盒測定，方法按試劑盒說明進(jìn)行。

1.6.3 抗體特異性的鑒定 將MAb腹水分別與流感病毒H1～H15亞型參考毒株及其他具有血凝活性的禽類病毒株(NDV、EDS)進(jìn)行血凝抑制交叉試驗(yàn)。血凝抑制陽性判為有交叉反應(yīng)，血凝抑制陰性判為無交叉反應(yīng)。

1.6.4 抗體與H1亞型的不同毒株交叉實(shí)驗(yàn) 選擇6株以前分離到的H1亞型流感病毒株，分別配制8單位抗原，利用A6F、2BBF和2BB MAb腹水分別對(duì)其進(jìn)行血凝抑制實(shí)驗(yàn)，檢測它們與6株H1亞型不同流感病毒株的抗原交叉反應(yīng)性。

1.6.5 針對(duì)現(xiàn)在流行的H1亞型SIV株的HI反應(yīng)將制備的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng),適時(shí)收集培養(yǎng)上清，并以雌性BALB/c小鼠制備腹水。利用得到的細(xì)胞株培養(yǎng)上清及腹水對(duì)來自于豬流感室的H1亞型SIV抗原進(jìn)行HI試驗(yàn)。

1.6.6 抗體疊加試驗(yàn) 將H1亞型SIV抗原以1∶160倍稀釋，100 μL/孔包被ELISA板，將雜交瘤腹水以10倍倍比稀釋，測定其飽和濃度。將MAb按飽和濃度分別兩兩配對(duì)，計(jì)算疊加后的增值指數(shù)。

1.6.7 與甲型H1N1流感病毒HA抗原的IFA檢測構(gòu)建A/California/04/2009A(H1N1)毒株的HA基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒ph1-PCAGGS，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后用預(yù)冷的甲醇丙酮(v∶v=1∶1)固定。用 H1亞型雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及sp2/0培養(yǎng)上清進(jìn)行IFA檢測，評(píng)價(jià)已制備的各個(gè)MAb與目前流行H1N1毒株抗原的交叉反應(yīng)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 MAb的篩選與雜交瘤細(xì)胞株的建立 經(jīng)過細(xì)胞融合、HI方法篩選及有限稀釋法克隆，共獲得11株能高效分泌具有血凝抑制活性的特異性MAb的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為5CC、A6F、1FE、2EE、 2BB、 8HB、 3DE、 2FG、 2BBF、 7FC 和1DH。

2.2 MAb的效價(jià)測定 HI方法測定11株MAb的腹水HI效價(jià)，結(jié)果顯示11株MAb HI效價(jià)11 log2～22 log2。

2.3 抗體亞類鑒定 利用SBAClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類鑒定試劑盒對(duì)11株MAb亞類鑒定的結(jié)果顯示：11株MAb中1FE、A6F和1DH為IgG2a亞型，8HB為IgG2b亞型， 2BBF、2BB和 3DE為 IgG3亞型，5CC、2EE、7FC和 2FG為IgG M亞型，輕鏈均為κ鏈。

2.4 MAb的特異性實(shí)驗(yàn) HI方法檢測結(jié)果顯示，11株MAb完全不與NDV和EDS病毒發(fā)生反應(yīng)，也不與其他亞型流感病毒發(fā)生血凝抑制反應(yīng)，表明11株MAb均能特異性識(shí)別H1亞型流感病毒的血凝素蛋白，具有良好的病毒特異性和亞型特異性。

2.5 MAb與亞型內(nèi)不同毒株的交叉反應(yīng)性 取其中3株MAb A6F、2BBF和2BB對(duì)我國不同地區(qū)分離株及豬源、禽源H1N1參考株進(jìn)行交叉抗原性分析，結(jié)果顯示：3株MAb與江蘇分離株A/Swine/Jiangsu/662/01(H1N1)及鴨源參考株A/Duck/Alberta/35/76(H1N1)等反應(yīng)性非常好，而與廣東的兩個(gè)分離株 A/Swine/Guangdong/710/01(H1N1)、A/Swine/Guangdong/729/01(H1N1)及豬源參考株A/Swine/Tennessee/26/77(H1N1)反應(yīng)性較差(表 1)，從而也可以看出我國不同地區(qū)分離株的抗原性差異較大，與我們制備的MAb反應(yīng)性表現(xiàn)出較大的差異，表明這3株MAb可為相關(guān)病毒株抗原性差異的研究提供新的思路和手段。

2.6 11株MAb對(duì)SIV H1亞型抗原的反應(yīng)性 利用這11株MAb對(duì)SIV H1亞型抗原進(jìn)行HI試驗(yàn)，結(jié)果表明A6F、8HB、2FG和2BBF對(duì)SIV H1抗原的HI效價(jià)較低(表2)。這表明現(xiàn)在流行的H1亞型SIV毒株可能與A/Swine/Guangdong/718/01(H1N1)的抗原性不同，也間接表明我國不同時(shí)期流行的H1病毒株抗原性變異的漸進(jìn)性。

表1 H1 MAb與不同毒株的HI試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The HI titration of MAbs against different H1 influenza virus strains

表2 11株MAb對(duì)SIV H1亞型標(biāo)準(zhǔn)抗原的反應(yīng)性Table 2 The HI titieration of MAbs to the H1 subtype swine influenza virus

2.7 MAb疊加試驗(yàn) 測定SIV H1亞型抗原的最佳包被濃度，根據(jù)測定結(jié)果以1∶160倍稀釋抗原，100 μL/孔包被ELISA反應(yīng)板。測定11株MAb腹水的飽和濃度，以1∶100稀釋腹水進(jìn)行MAb疊加試驗(yàn)。計(jì)算各配對(duì)的增值指數(shù)(AI)，大于10%的配對(duì)MAb有：1FE 和 8HB(AI為 14%)、1FE 和 2BBF(AI為 17%)、8HB和3DE(AI為 44%)、8HB 和 1DH(AI為 49%)、3DE 和 7FC(AI為 47%)、1DH 和 7FC(AI為 42%)，結(jié)果表明，這些配對(duì)MAb可能識(shí)別不同的抗原決定簇，可進(jìn)一步被用來建立針對(duì)H1亞型SIV的雙抗體夾心ELISA方法及免疫金標(biāo)記檢測方法，為我國目前豬流感的監(jiān)測提供快速準(zhǔn)確的新方法。

2.8 針對(duì)A/California/04/2009A(H1N1)株HA抗原的IFA檢測 將A/California/04/2009A(H1N1)的HA基因序列插入到pCAGGS質(zhì)粒上構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-H1，轉(zhuǎn)化擴(kuò)增得到重組質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)鑒定正確后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，同時(shí)以pCAGGS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞做為陰性對(duì)照，以11株雜交瘤細(xì)胞及SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清對(duì)轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞分別進(jìn)行 IFA試驗(yàn),結(jié)果表明 2BBF、8HB、1DH、7FC和2BB可以特異性識(shí)別293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的HA抗原，空載體轉(zhuǎn)染組及SP2/0陰性對(duì)照則不反應(yīng)(圖1)，從而證實(shí)這些MAb可以識(shí)別今年爆發(fā)的甲型H1N1流感株(A/California/04/2009A)，可用來針對(duì)目前流行H1N1毒株開展診斷工作，為其快速診斷方法的建立提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

為更好開展豬H1N1亞型流感的研究，提高豬流感診斷方法的特異性和敏感性，我們研制了一系列的H1亞型特異性MAb，以期能夠?qū)Ξ?dāng)前流行的H1亞型流感病毒進(jìn)行特異性快速診斷。本研究制備MAb與不同H1亞型流感病毒株的HI反應(yīng)結(jié)果表明，我國不同地區(qū)不同時(shí)期病毒分離株的抗原性存在一定的差異，不同MAb針對(duì)不同毒株的反應(yīng)性有所不同，表明H1病毒在流行進(jìn)化過程中其相關(guān)抗原位點(diǎn)發(fā)生一定改變，從而導(dǎo)致疫苗使用效果不佳，是當(dāng)前流感疫苗預(yù)防和防疫中應(yīng)該高度重視的問題。MAb識(shí)別譜的差異性不僅僅在H1亞型內(nèi)發(fā)生，其他亞型流感病毒，如H5和H9亞型病毒也普遍存在這種現(xiàn)象，流感病毒抗原性漂變是流感病毒變異的一個(gè)重要特性。本研究研制的具有HI活性的H1亞型SIV特異性MAb，盡管對(duì)于不同分離株血凝抑制作用有一定差異，但是大部分MAb可以良好識(shí)別國內(nèi)目前H1亞型SIV流行株，部分MAb也可以識(shí)別目前大流行的H1病毒株，這些特異性MAb的制備可以為H1亞型流感監(jiān)測提供有力工具，為新型H1亞型流感病毒的快速診斷試劑的研制提供了物質(zhì)保障。由于不同來源的豬、禽流感病毒或人源流感病毒都可以感染豬，并在豬體內(nèi)重組，產(chǎn)生新的重組病毒，其特性有可能發(fā)生改變，從而導(dǎo)致新型流感病毒傳染人或在豬群內(nèi)流行。因此，加強(qiáng)國內(nèi)H1亞型SIV流行毒株監(jiān)測不僅對(duì)于我國動(dòng)物養(yǎng)殖是十分必要的，而且對(duì)于公共衛(wèi)生也具有重要意義。2009年爆發(fā)的新型H1N1流感就是一個(gè)典型的病毒重組變異的結(jié)果。目前，甲型H1N1流感已經(jīng)席卷全球，給人類健康威脅，各國對(duì)甲型H1N1流感的防控已經(jīng)提高到前所未有的高度。

本研究制備的具有血凝抑制活性的H1亞型流感病毒特異性的MAb，具有良好的流感病毒亞型特異性，而且可以識(shí)別當(dāng)前流行的甲流毒株的HA抗原，為H1亞型流感病毒的快速鑒別診斷和相關(guān)抗原性基礎(chǔ)研究奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)甲型流感疫情的防控也有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

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