宋陽威，張鑫宇，張常印，吳亞力，孫懷昌，唐泰山，張敬友

(1.徐州出入境檢驗檢疫局，江蘇徐州221006；2.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州225009；3.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇南京210001)

牛白血病(Bovine leukaemia，BL)又稱地方流行性牛白血病，是由牛白血病病毒(Bovine leukaemia virus，BLV)引起牛的一種慢性腫瘤性疾病，其特征為淋巴樣細胞惡性增生，進行性惡病質和發(fā)病后的高死亡率[1]。在我國該病于1974年首次發(fā)現(xiàn)于上海，繼而在合肥、江蘇、陜西、烏魯木齊和江西等省市發(fā)生，而且有逐漸擴大蔓延的趨勢，在某些牛群中血清陽性率達30%～50%，已成為牛的重要傳染病之一[2]。

BLV的囊膜上有GP51和GP30兩種糖蛋白，其中GP51是BLV重要抗原之一，可以刺激機體產生相應的抗體[3]，根據(jù)該特點，本實驗表達并純化了GP51重組蛋白，應用膠體金免疫層析技術，建立了BLV感染?？焖僭\斷膠體金免疫層析試紙條檢測方法。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 感染BLV的FLK細胞由連云港出入境檢驗檢疫局惠贈；膠中回收DNA試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司；載體pET32a(+)、大腸桿菌宿主細胞BL21、TG1購于Pharmacia公司；抗BLV標準陽性血清和陰性血清購于Institute POURQUIER；Protino Ni-TED2000 packed columns購于Macherey-Nagel公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗?？贵w、羊抗牛IgG抗體購于Rocland公司；羊抗牛IgG(Fc)抗體購于NORDIC IMMUNO LOGY公司；牛白血病臨床血清樣品和牛傳染性鼻氣管炎、牛病毒性腹瀉-粘膜病、赤羽病、藍舌病和副結核陽性血清由本課題組保存；納米金溶液購于上海滬正納米(NANO)技術有限公司。

1.2 gp51基因擴增及重組表達質粒構建

1.2.1 gp51基因的PCR擴增 收獲感染BLV的FLK細胞，提取DNA，作為PCR擴增模板。根據(jù)Sagata等[4]發(fā)表的序列，合成特異性引物，上游引物：5'-GCGAATTCTGGAGATGCTCCCTGTC-3'，下游引物：5'-GCCTCGAGTTAACGTCTGACCCGGGT AG-3'。PCR反應參數(shù)：94℃ 2 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 7 min。PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 重組表達質粒構建 將PCR產物進行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，電泳回收目的片段并與pMD18-T載體連接，轉化感受態(tài)E.coliTG1，提取質粒，進行酶切和PCR鑒定，將測序驗證正確的陽性質粒命名為pMD-gp51。

將pET32a載體和重組質粒pMD-gp51進行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，分別回收載體片段和目的基因片段。純化的雙酶切純化產物進行連接，將連接產物轉化DH5α感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，提取質粒，進行酶切和PCR鑒定。

1.3 重組質粒的誘導表達及表達產物鑒定、純化將重組菌接種2×YTA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600nm為0.8～1.0時，加入終濃度為1 mmol/L IPTG誘導表達4 h，收集菌體沉淀和上清進行SDS-PAGE電泳；同時設立未誘導重組菌以及誘導的含空載體宿主菌作為對照。按照Protino Ni-TED2000 packed columns說明書，從誘導的重組菌中分離包涵體，用Ni柱純化重組蛋白，按文獻[5]所述方法對重組蛋白進行western blot，分析其免疫反應原性。

1.4 膠體金免疫層析試紙條制備

1.4.1 待標記羊抗牛IgG(Fc)抗體最佳標記用量的確定 將待標記羊抗牛IgG(Fc)抗體作系列稀釋，分別取0.05 mL加到0.5 mL膠體金溶液中，另設1管不加抗體的對照管，5 min后加入0.05 mL 10%NaCl溶液，混勻后靜置2 h后觀察結果，以膠體金顏色不發(fā)生改變的最高稀釋倍數(shù)為準，在此基礎上再加20%的抗體即為最佳標記量。參考文獻[6]的方法，將羊抗牛IgG(Fc)抗體用膠體金進行標記。

1.4.2 金標羊抗牛IgG(Fc)抗體純化 將金標羊抗牛IgG(Fc)抗體溶液4℃、2 000 r/min離心10 min，取上清；再進行4℃、12 000 r/min離心30 min，收集紫紅色沉淀，用0.005 mol/L硼酸鹽緩沖液溶解，4℃保存。

1.4.3 標記物工作濃度的確定 純化的金標抗體作1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 不同稀釋度，制備試紙條分別檢測BLV標準陽性和陰性血清。根據(jù)檢測線顯色深度與顯色時間等指標確定金標抗體的工作濃度；固定金標抗體濃度，將標記于檢測線上的GP51蛋白作倍比稀釋后制備試紙條，分別檢測BLV標準陽性和陰性血清。根據(jù)檢測線顯色深度與顯色時間等指標確定檢測線上GP51蛋白的工作濃度；固定金標抗體和GP51蛋白的工作濃度，將加于質控線上的羊抗牛IgG抗體作倍比稀釋后制備試紙條分別檢測同一份標準陽性血清，根據(jù)檢測線與質控線的顯色情況確定羊抗牛IgG抗體工作濃度。

1.4.4 膠體金免疫層析試紙條的制備 將玻璃纖維制成的樣品墊、膠體金墊、包被有檢測(T)線和質控(C)線的硝酸纖維素膜及吸水濾紙制成的吸水墊按照示意圖1裝配，干燥密封，室溫保存。

1.4.5 試紙條檢測方法 將待檢牛血清作50倍稀釋，取15 μL加在試紙條的加樣區(qū)，5 min～10 min后觀察結果。

1.5 評價試驗

1.5.1 特異性和敏感性測試 用試紙條檢測牛傳染性鼻氣管炎、牛病毒性腹瀉-粘膜病、赤羽病、藍舌病和副結核等陽性血清，觀察其特異性。將BLV標準陽性血清作 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100 倍稀釋，分別用試紙條檢測并觀察其敏感性。

1.5.2 重復性和穩(wěn)定性試驗 用同批和不同批次的試紙條分別檢測BLV標準陰性血清和陽性血清，重復5次，檢測其重復性。試紙條分別存放于室溫和4℃，每隔2個月取出檢測標準陽性血清，連續(xù)4次，檢測其穩(wěn)定性。

1.5.3 現(xiàn)地樣本檢測 用組裝的試紙條對22份已知牛血清樣品(該樣品已用美國IDEXX公司ELISA試劑盒進行了檢測，其中9份檢測為陽性，13份檢測為陰性)進行檢測，并計算試紙條與ELISA檢測結果的符合率。

2 結 果

2.1 gp51基因的擴增及重組質粒鑒定 通過PCR反應，從感染BLV的FLK細胞基因組中擴增出約為820 bp的條帶(圖2)，與預期大小相符?；厥赵揇NA片段，測序分析。測序結果與GenBank中登錄的序列(K02120)進行比較，有3處發(fā)生點突變：100位T→C，348位C→T，510位T→C，但在氨基酸水平上無任何變化。將該片段連接到pET32a(+)中重組表達質粒用PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切進行鑒定，結果表明獲得陽性重組表達質粒，命名為pET-gp51。

2.2 表達產物的SDS-PAGE和western blot鑒定

IPTG誘導含有pET-gp51質粒的重組大腸桿菌，SDS-PAGE的分析結果顯示在42 ku大小處出現(xiàn)一有別于對照樣品的蛋白條帶(圖2)，Western blot顯示，在42 ku處有1條清晰的蛋白印跡帶，與SDS-PAGE的分析結果一致(圖2)。

2.3 羊抗牛IgG(Fc)抗體最佳標記用量及標記物工作濃度的確定 膠體金標記羊抗牛IgG(Fc)抗體最適穩(wěn)定量的測定結果顯示，穩(wěn)定膠體金的最低抗體質量為5 μg/mL，最終確定抗體最佳標記濃度為6 μg/mL。點樣于硝酸纖維素膜上的GP51和羊抗牛IgG抗體最佳濃度分別為 120 μg/mL 和 200 μg/mL。

2.4 試紙條結果判定 T線和C線均出現(xiàn)紅色，結果為陽性；C線顯紅色，T線不顯色，結果為陰性；C線不出現(xiàn)紅色，結果無效(圖3)。

2.5 特異性和敏感性測試 通過對牛傳染性鼻氣管炎、牛病毒性腹瀉-粘膜病、赤羽病、藍舌病和副結核等陽性血清進行檢測，結果無一例陽性出現(xiàn)，說明試紙條特異性良好。對作系列稀釋的標準陽性血清分別進行檢測，結果1∶70倍稀釋的血清仍呈陽性，說明試紙條的敏感性較好。

2.6 重復性和穩(wěn)定性試驗 不同批次的試紙條進行批內和批間重復性試驗，符合率為100%。試紙條分別在室溫和4℃下保存6個月，其特異性和靈敏性均沒有變化，8個月后靈敏度均下降，表明試紙條重復性較好且具有一定的穩(wěn)定性。

2.7 臨床樣品檢測及符合率 試紙條對22份已知牛血清進行了檢測，其中ELISA檢測陽性的9份牛血清中，有8份試紙條檢測為陽性，陽性符合率為88.89%(8/9)；ELISA檢測為陰性的13份血清樣品中，11份試紙條檢測為陰性，陰性符合率為84.62%(11/13)。

3 討 論

目前，還沒有有效防治該病的疫苗或方法，對感染的牛只能實行隔離或淘汰[7]，因而早期診斷是十分重要的。BLV檢測主要有電鏡檢查、合胞體感染試驗和PCR，但這些試驗費時，并且需特殊的儀器設備，因此目前應用得較少。常用血清學方法也存在靈敏度低，操作要求高或價格昂貴等問題，不適用于基層和大規(guī)模檢測。

由于膠體金標記蛋白質是一物理結合過程，結合牢固，試劑非常穩(wěn)定，不受溫度等外界因素影響，可在實驗室，甚至野外進行檢測[8]。膠體金對比ELISA大大簡化了操作，更適合于野外臨床的現(xiàn)場應用[9]，也不會污染環(huán)境[10]。因為“免疫濃縮”效應存在，免疫膠體金實驗所需試劑和樣本量都非常少，樣本量可低至1 μL～2 μL[11]。因此該技術有良好的應用前景。

本研究從感染了BLV的FLK細胞中擴增出GP51基因，測序后與Sagata等發(fā)表的序列進行比較，有3處發(fā)生了沉默點突變。利用表達的GP51蛋白，建立間接膠體金免疫層析檢測方法，組裝出檢測BLV GP51抗體的試紙條，通過檢測抗體的有無來判定被檢牛是否感染BLV。經對部分臨床樣本進行檢測，結果與進口試劑盒檢測符合率在86.8%左右，分析原因，一方面可能與本研究所檢測的樣品較少有關，另外膠體金免疫技術目前還不是十分成熟，其靈敏度及穩(wěn)定性等還有待進一步提高。但該方法具有操作極其簡單，無需特殊儀器設備，更適宜基層檢測機構進行初篩診斷和現(xiàn)場檢測。相信隨著相關技術的不斷發(fā)展與完善，本研究建立的快速診斷膠體金免疫層析試紙條檢測方法將具有良好的應用前景。

[1]龍塔，潘耀謙.流行性牛白血病的病原及傳播途徑研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2005，25(6)：65-68.

[2]龔海燕，彭遠義.牛白血病病毒感染的免疫學研究進展[J].畜牧與獸醫(yī)，2002，34(6)：41-43.

[3]Bicka L,Kuzmak J,Kozaczynska B,et a1.Expression of bovine leukemia virus protein p24 in Escherichia coli and its use in the immunoblotting assay[J].Acta Biochimica Polonica,2001,48(1):227-232.

[4]Sagata N,Yasunaga T,Tsuzuku Kawamura J,et al.Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus:its evolutionary relationship to other retroviruses[J].Proc Natl Acad Sci,1985,82(3):677-681.

[5]奧斯伯F M，布倫特R，金斯頓R E，等.精編分子生物學實驗指南[M].金由辛等譯.北京：科學出版社，2008.

[6]唐景峰，李曉艷，王興龍，等.布病膠體金免疫層析檢測方法的建立[J].中國生物制品學雜志，2007，20(2)：119-128.

[7]Acaite J,Tamosiunas V,Lukauskas K,et al.The eradication experience of enzootic bovine leukosis from Lithuania[J].Prev Vet Med,2007,82:83-89.

[8]馬紅艷，李強，韓雪松，等.膠體金診斷試劑盒中層析膜材料性能的分析[J].膜科學與技術，2002，22(6)：14-19.

[9]蔣韜，梁仲，陳涓，等.O型口蹄疫病毒免疫層析試紙條檢測方法的建立[J].畜牧獸醫(yī)學報，2008，39(1)：60-65.

[10]楊素，陳博文，沙才華，等.赤羽病膠體金免疫層析試紙條的研制[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(3)：42-44.

[11]許保疆，郭成留.免疫層析快速診斷試紙條的制備及在動物疫病診斷上的應用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(3)：48-51.