徐廣賢，周 晶，李 娟，賈 浩，王玉炯*

(1.寧夏大學生命科學學院，寧夏銀川750021；2.寧夏醫(yī)科大學檢驗學院，寧夏銀川750004)

牛結(jié)核病是一種人獸共患傳染病，可通過吸入含菌氣溶膠或食用受污染的乳制品而傳染人[1]。牛分枝桿菌(Mycobaeterium bovis)是引起牛結(jié)核病的病原體，其宿主廣泛，可感染多種家畜和野生動物，對人類和動物的健康構(gòu)成危害[2]。

研究表明，M.bovis的一些磷脂代謝途徑，與其致病性有關(guān)[3-4]。溶血磷脂酶(Lysophospho lipase，LIP)主要催化溶血磷脂水解為磷酸甘油和溶血磷脂酸，是催化其失活的主要途徑，被認為在調(diào)節(jié)生物活性脂質(zhì)水平中起關(guān)鍵作用[5]。溶血磷脂是磷脂代謝的中間產(chǎn)物，通常呈低水平廣泛分布于各種生物的細胞膜上，具有除垢劑樣特性和溶膜特征，是一種很強的生物活性因子[6]。

為了研究LIP基因在M.bovis致病機理中的作用，本研究對M.bovis的LIP基因進行克隆、原核表達，為進一步研究其LIP的功能及其生物學效應奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料M.bovis菌C 68-2株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；表達載體pET30a及DH5α和BL21菌株由本實驗室保存。

1.2 目的基因的克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中登錄的M.bovis的LIP基因核苷酸序列，用primer 5.0軟件設計引物，并由上海Sagon公司合成。上游引物LIP-S：5'-ATATGGTACCGAGCAT GCCCGCCGCTACGAC-3'；下游引物LIP-AS：5'-GT ACGAGCTCCTACAACCGCTCGGTGAGCCAG-3'(下劃線分別為KpnⅠ和SacⅠ酶切位點)。

采用CTAB方法提取M.bovis基因組DNA[7]，以其為模板，參照ExTaqPCR試劑盒(TaKaRa)對LIP基因進行PCR擴增。PCR反應總體積為50 μL。PCR程序：95℃ 3 min；95℃ 1 min、60℃ 1 min、72℃1 min，30個循環(huán)；然后72℃ 10 min。反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用EZ-10Spin Colunm DNA Gel Extraction試劑盒回收740 bp左右DNA片段，經(jīng)SacⅠ和KpnⅠ雙酶切后，與用經(jīng)過同相雙酶切的pET30a(+)連接過夜，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，并命名為pET30a-LIP，并對目的基因進行測序鑒定。

1.3 重組蛋白的誘導表達 將重組菌37℃培養(yǎng)至OD600nm約0.8時，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，于37℃誘導6 h。分別于誘導前和誘導后取出1 mL細菌培養(yǎng)物，離心，收集沉淀菌體，裂解后進行SDS-PAGE分析。

1.4 Western blot分析 SDS-PAGE電泳后，通過電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，經(jīng)脫脂牛奶封閉，二抗為辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠抗體，用DAB顯色。兔抗一抗為M.bovis多克隆抗體進行免疫反應檢測。

1.5 重組蛋白的純化 超聲波破碎菌體，沉淀經(jīng)過包涵體洗滌液洗滌后，用含8 mol/L尿素的包涵體溶解液溶解。上清經(jīng)梯度透析復性后進行SDSPAGE電泳，用預冷的0.25 mol/L KCl浸泡膠至顯示出乳白色的蛋白條帶，切下目的條帶放入透析袋內(nèi)，洗脫目的蛋白，取樣進行SDS-PAGE電泳。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組蛋白的誘導表達與SDS-PAGE分析 經(jīng)IPTG誘導的重組菌進行SDS-PAGE分析，結(jié)果在預期的30 ku處出現(xiàn)特異的蛋白條帶，表達量占菌體總蛋白的20%。對照空載體質(zhì)粒沒有特異表達條帶(圖 1)。

2.2 重組蛋白的western blot分析 Western blot結(jié)果顯示，重組菌株在30 ku處出現(xiàn)目的條帶(圖2)，由此證明，該特異性蛋白條帶為M.bovis的LIP重組蛋白，同時可與兔抗M.bovis多克隆抗體結(jié)合，表明LIP具免疫反應性(圖2)。

2.3 重組蛋白的純化 超聲波破碎后的菌體，經(jīng)過SDS-PAGE檢查，結(jié)果表明目的蛋白主要以包涵體的形式存在。重組蛋白經(jīng)過電洗脫回收，對純化蛋白進行薄層掃描分析，表明蛋白的純度可達95%以上(圖 3)。

LIP是催化溶血磷脂失活的主要途徑，在控制體內(nèi)溶血磷脂的水平以保持正常的生物學功能方面起著重要作用。本研究克隆并構(gòu)建了M.bovis的LIP原核表達重組質(zhì)粒，經(jīng)過對表達條件如IPTG的含量、誘導溫度和誘導時間等方面的優(yōu)化，使得LIP獲得高效表達。在蛋白質(zhì)純化方面，其純化方法與親和層析回收蛋白的方法相比具有時間短、效率高的特點，可少量用于制備目的蛋白。免疫印跡分析表明，原核表達的蛋白可與兔抗M.bovis多克隆抗體結(jié)合，并且具特異的免疫反應性，為進一步研究其生物學效應奠定了基礎。

[1]Smith R M,Drobniewski F,Gibson A,et al.Mycobacterium bovisinfection,United kingdom[J].Emerg Infect Dis,2004,10:539-541.

[2]朱建國，華修國，高謙.應用基因分型技術(shù)研究牛結(jié)核分枝桿菌分子流行病學[J].上海交通大學學報(農(nóng)業(yè)科學版)，2006，24(6)：567-568.

[3]Kremer L,De Chastellier C,Dobson,G,et al.Identification and structural characterization of an unusual mycobacterial monomeromycolyl-diacylglycerol[J].Mol Microbiol,2005,57,1113-1126.

[4]Cotes K,Dhouib R,Douchet I,et al.Characterization of an exported monoglyceride lipase fromMycobacteriumtuberculosis possibly involved in the metabolism of host cell membrane lipids[J].Biochem J.(2007)408,417-427.

[5]Maury E,Prevost M C,Nauze M,et al.Human epidermis is a novel site of phospholipase B expression[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,295(2):362-369.

[6]Aijun W,Raymond A,Deems T,et al.Cloning,expression,and catalytic mechanism of murine lysophosphplipase 1[J].J Biol Chem,1997,272(19):12723-12729.

[7]Van Embden J D,Donald C M,Crawford J T,et al.Strain identification ofMycobacteriumtuberculosis by DNA fingerprinting:Recommendations for a standardized methodology[J].J Clin Microbiol,1993,31:2446-2450.