朱遠茂，任憲剛，史鴻飛，高欲燃，于 作，馮軍科，相文華*，薛 飛*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/大動物傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001；3.哈藥集團生物疫苗有限公司，黑龍江哈爾濱150030)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(FMDV)感染偶蹄動物所引起的急性、接觸性傳染病[1]。FMDV有7個血清型，即A、O、C、亞洲Ⅰ型(Asia 1)和南非Ⅰ(SAT1)、SAT2、SAT3[2]。Asia 1 FMDV于1954年分離于巴基斯坦，我國于1958年在云南省首次發(fā)現(xiàn)Asia 1 FMD。給我國的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失[3]。FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1是主要免疫原性蛋白，能夠誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生較高水平的抗體從而保護機體免受FMDV攻擊[4]。人工合成的Asia 1型FMDV第133位～163位的多肽能夠刺激豚鼠產(chǎn)生高水平的中和抗體[5]。在FMDV基因工程苗的研制、診斷方法的建立等領(lǐng)域，VP1蛋白是被關(guān)注的熱點[6]。

本研究利用原核表達系統(tǒng)進行Asia 1 FMDV VP1結(jié)構(gòu)蛋白的表達，并制備多克隆抗體，對于FMDV Asia 1的VP1蛋白抗原性、免疫原性及其蛋白功能研究具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及血清 含Asia 1 VP1基因的質(zhì)粒pUC57-Asia VP1由本實驗室構(gòu)建保存(Asia 1 VP1基因由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)；原核表達載體 pET-30a(+)、大腸桿菌 DH5α、BL21(DE3)、牛FMDV陽性血清和陰性血清、BHK細胞、FMDV Asia 1 JS/China/2005為本實驗室保存；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG、兔抗牛IgG均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑 ExTaq酶、DNA Marker DL2000、IPTG為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶、BamHⅠ、HindⅢ為Promega產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒為上海華舜公司產(chǎn)品；蛋白純化試劑Ni-NTA Purification System為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.3 實驗動物 2 kg～3 kg新西蘭白兔由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。

1.4 VP1基因的擴增及回收 PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，上游引物vp1F：5'-ATTAGGATCCTCAGCGGACCCAGTGACA ACCAC-3'；下游引物vp1R： 5'-CGCCAAGCTTATT ACAGTACCTGTTTCTCAGGTG-3'，在上下游引物中分別引入BamHⅠ、HindⅢ位點。PCR擴增條件為：95℃3 min；94℃45 s、60℃45 s、72℃1 min，30個循環(huán)后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收。

1.5 VP1基因的克隆與鑒定 將回收的PCR產(chǎn)物與pET-30a(+)載體分別用BamHⅠ、HindⅢ進行雙酶切后回收，T4 DNA連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α。提取重組質(zhì)粒(pET-VP1)，用雙酶切鑒定。陽性的克隆進行測序做進一步鑒定。

1.6 重組VP1蛋白(rVP1)的表達 將pET-VP1轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL21(DE3)，進行增菌培養(yǎng)，以終濃度為1.0 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)，同時設(shè)立未誘導(dǎo)對照，誘導(dǎo)6 h后，收集菌體。以SDS-PAGE檢測。同時用超聲波破碎菌體，離心后分別收集上清及沉淀表達的rVP1可溶性檢測。

1.7 表達產(chǎn)物的純化 將誘導(dǎo)表達菌裂解處理后按文獻[7]的方法，對包涵體形式表達的重組蛋白進行純化。以分光光度計測定蛋白含量。

1.8 表達產(chǎn)物的鑒定

1.8.1 表達產(chǎn)物的western blot分析 將純化后的rVP1蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，以1%明膠37℃封閉1 h，分別以FMD陽、陰性牛血清(1∶100稀釋)為一抗，37℃孵育1 h，以HRP標記的兔抗牛IgG(1∶5 000稀釋)為二抗，37℃孵育1 h，用4-氯-1萘酚顯色。

1.8.2 表達產(chǎn)物間接ELISA檢測 純化的rVP1以1 μg/孔包被酶標板，4℃過夜，用1%明膠37℃封閉1 h，分別以8份FMD陰性及陽性血清作為一抗(與大腸桿菌作用后1∶100稀釋），37℃作用 1 h，PBST洗滌后加入HRP標記的兔抗牛IgG(1∶5 000稀釋)，37℃作用1 h，PBST洗滌后，加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)37℃避光顯色 5 min，加 50 μL 2 mol/L硫酸終止，用酶標儀測定OD630nm值。

1.9 兔抗VP1蛋白多克隆抗體的制備 取純化的rVP1蛋白4 mg，與等體積的弗氏完全佐劑(Sigma)進行乳化后于新西蘭白兔雙后足掌皮下注射進行第一次免疫；每只足掌2 mg/0.5 mL，2周后于雙側(cè)后肢腘淋巴結(jié)內(nèi)各注射2 mg/0.5 mL上述抗原進行第二次免疫；2周后于背部皮下多點注射4 mg/1 mL經(jīng)弗氏不完全佐劑進行乳化后的抗原進行第3次免疫；2周后于耳靜脈注射4 mg/mL的不加佐劑的抗原0.5 mL進行加強免疫。1周后耳靜脈采血測定效價，效價達到要求后心臟采血分離血清。

1.10 兔抗VP1蛋白抗體效價的測定

1.1 0.1 間接ELISA效價的測定 以純化的rVP1蛋白包被酶標板1 μg/孔，陰性兔血清和抗VP1兔血清進行1∶20～1∶81 920倍比稀釋，以HRP標記的山羊抗鼠IgG為二抗(1∶5 000)，按1.8.2的程序進行間接ELISA試驗，以免疫血清與陰性血清OD630nm值的比值大于2.5判定為陽性。

1.1 0.2 中和抗體效價的測定 采用BHK細胞，以兔抗VP1血清對Asia 1 FMDV進行中和試驗，每個血清稀釋度重復(fù)4孔，以能中和2孔的血清稀釋度為中和效價。

2 結(jié) 果

2.1 VP1基因的擴增及表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示約600 bp的擴增條帶，與預(yù)期639 bp相符。重組表達質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ消化后可見約600 bp及5 200 bp目的片段和載體片段。

2.2 VP1基因的表達與純化 重組菌用IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳證明VP1基因獲得了表達，表達產(chǎn)物大小約為31.6 ku(圖1)。將重組菌超聲波破碎后的上清和沉淀分別做SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示rVP1蛋白以包涵體的形式表達。包涵體經(jīng)洗滌后用含8 M尿素的PBS緩沖液溶解后獲得初步純化的rVP1，再經(jīng)Ni-NTA Purification system純化后，稀釋并透析復(fù)性后得到純化的rVP1蛋白。

2.3 表達產(chǎn)物的western blot分析 將純化后的rVP1進行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，分別以牛FMD陽、陰性血清為一抗，兔抗牛IgG為二抗，結(jié)果顯示rVP1蛋白與FMD陽性血清反應(yīng)，可在31.6 ku處出現(xiàn)特異性免疫印跡條帶，與FMD陰性血清不反應(yīng)(圖2)。

2.4 重組VP1的間接ELISA檢測 以純化的rVP1作為包被抗原，對經(jīng)進口ELISA試劑盒(惠贈)鑒定的FMD Asia 1抗體陰、陽性牛血清各8份進行間接ELISA檢測。結(jié)果顯示8份陽性血清的OD630nm值均在1.0以上，8份陰性血清的OD630nm值都在0.2以下，每個樣品的OD630nm值為兩個檢測孔的平均值，與進口ELISA試劑盒檢測結(jié)果相符(表1)。

2.5 兔抗VP1蛋白多克隆抗體效價的測定 純化的蛋白經(jīng)過4次免疫新西蘭白兔后，心臟采血分離血清。對高免血清進行間接ELISA檢測和病毒中和試驗測定其效價。結(jié)果表明ELISA效價可達10×211，即 1∶20 480(圖 3)；病毒中和試驗效價可達 1∶64。

表1 rVP1的間接ELISA與進口檢測試劑盒的比較Table 1 Comparison of the indirect rVP1 based ELISA with commercial FMD ELISA kit

3 討 論

VP1基因在FMDV的研究中具有重要的地位。Suryanarayana等將FMDV VP1的C端部分在大腸桿菌中進行表達，證明表達蛋白經(jīng)純化后用免疫沉淀反應(yīng)法檢測到特異性抗體產(chǎn)生[8]。近年來國內(nèi)許多研究者對Asia 1 FMDV開展了研究，尤其對VP1基因的研究比較多，包括基因測序和分析，單克隆抗體的制備，表位鑒定，在原核、真核和畢赤酵母中進行表達等[9-10]。張中旺等制備了FMDV Asia 1/HeB P1衣殼蛋白前體的抗血清，僅用表達蛋白測定了抗血清效價，但未進行中和活性的檢測[11]，在家兔中制備VP1多克隆抗體還未見報道。

本研究利用原核表達了FMDV Asia 1 IND 4/2004株的VP1全基因。表達產(chǎn)物分子量約為31.6 ku，以包涵體的形式存在。我們曾試圖通過調(diào)整誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度以求獲得可溶性表達，但結(jié)果仍然是以包涵體的形式表達。這可能與蛋白質(zhì)本身的氨基酸組成有關(guān)，僅僅改變表達菌的培養(yǎng)條件并不能從根本上改變表達形式。Western blot和間接ELISA分析結(jié)果顯示rVP1能夠與FMD陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的抗原性。本研究以純化的包涵體蛋白VP1免疫新西蘭白兔制備了多克隆抗體，該抗體ELISA效價達到1∶20 480，病毒中和試驗抗體效價為1∶64，這是國內(nèi)首次制備特異性的兔抗Asia 1 FMDV VP1基因的多抗，而且能中和我國目前使用的疫苗毒株FMDV Asia 1 JS/China/2005，顯示出良好的中和活性。

因此，本研究獲得的rVP1可用于開發(fā)檢測Asia 1 FMDV抗體的診斷試劑，所制備的多克隆抗體為進一步研究VP1的結(jié)構(gòu)、功能以及抗原表位的鑒定奠定了基礎(chǔ)。

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