萬(wàn)曉朋，曾顯營(yíng)，田國(guó)彬，李雁冰，鄧國(guó)華，施建忠，劉麗玲，鐘功勛，姜永萍，王彥妮，陳化蘭

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150001)

H9N2亞型禽流感(Avian influenza，AI)是持續(xù)危害我國(guó)及世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要禽類傳染病之一[1-2]，同時(shí) H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)還可感染人，提供內(nèi)部序列與H5N1亞型禽流感病毒重組[2-4]；并且具有人流感病毒的受體結(jié)合位點(diǎn)[3]，因此對(duì)H9N2亞型AI的研究具有重要的經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生意義。

我國(guó)自1994年首次報(bào)道從雞群分離到H9N2亞型AIV以來(lái)[5]，該亞型病毒已在我國(guó)廣泛分布和流行[2]，并且在家禽中不斷地進(jìn)化[6-7]。疫苗免疫是控制H9N2亞型AI的重要措施之一，我國(guó)有多種不同廠家研制和生產(chǎn)H9N2亞型AI滅活疫苗，在我國(guó)大范圍應(yīng)用。然而，由于種種因素，目前H9N2亞型AIV仍然在我國(guó)持續(xù)流行。為篩選出具有良好免疫效果的疫苗株，本研究選取2008年分離自8個(gè)省份的15株H9N2亞型AIV進(jìn)行分析，選擇代表毒株進(jìn)行鑒定并制備滅活疫苗，免疫SPF雞進(jìn)行免疫效力研究，期待篩選出適合我國(guó)大部分地區(qū)應(yīng)用的H9N2亞型AI滅活疫苗理想種毒株。

1 材料和方法

1.1 病毒株和血清 18株H9N2亞型AIV由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存，其中15株2008年分離病毒來(lái)源于湖南、廣西、福建、山東、浙江、安徽、湖北、四川8個(gè)省份(表1)。病毒抗血清由國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室制備、保存。

表1 H9N2亞型禽流感病毒分離株及簡(jiǎn)稱Table 1 H9N2 subtype AIV isolates and abbreviation

1.2 SPF雞胚和SPF雞 9日齡～11日齡SPF雞胚和4周齡～8周齡SPF雞均購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，感染實(shí)驗(yàn)在負(fù)壓隔離器中進(jìn)行。

1.3 病毒的抗原性分析 選取病毒，制備抗血清，采用血凝(HA)-血凝抑制(HI)試驗(yàn)(GB/T 18936-2003)進(jìn)行病毒抗原性分析。

1.4 毒株HA基因同源率比較 對(duì)疫苗株和攻毒株GS/JS/106/08、CK/SC/83/08 和 DK/FJ/22/08， 進(jìn) 行HA基因測(cè)序，與目前用于制備H9亞型HI試驗(yàn)抗原的CK/SH/10/01株序列一起用Megalign進(jìn)行同源率分析。

1.5 毒株的雞胚半數(shù)感染量(EID50)測(cè)定 將病毒株用無(wú)菌生理鹽水作10倍倍比稀釋，取10-5～10-106個(gè)稀釋度，各尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5個(gè)，37℃培養(yǎng)72 h后，逐個(gè)測(cè)定雞胚尿囊液HA價(jià)，利用Reed-Muench法計(jì)算病毒EID50。

1.6 候選疫苗株對(duì)SPF雞的致病性 分別將制備疫苗用病毒以106EID50(0.1 mL/只)的劑量滴鼻接種3周齡～4周齡SPF雞10只，另取條件相同的SPF雞10只，不接種作為對(duì)照，在相同條件下分別飼養(yǎng)，在14 d內(nèi)觀察感染雞是否出現(xiàn)死亡或明顯異常反應(yīng)。

1.7 病毒株的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將制備疫苗用毒種分別以無(wú)菌生理鹽水作10-4稀釋，各接種9日齡～11日齡SPF雞胚5個(gè)，收取尿囊液，在雞胚上連續(xù)傳15代，用HA試驗(yàn)檢測(cè)每個(gè)代次的雞胚尿囊液血凝價(jià)，同時(shí)觀察胚體有無(wú)肉眼可見病變。

1.8 滅活疫苗免疫效力試驗(yàn) 將H9N2亞型候選疫苗株以常規(guī)方法制備油乳劑滅活苗，分別以0.3 mL/只的劑量免疫3周齡SPF雞。免疫21 d時(shí)，采集血清，用商品化的H9亞型抗原和相應(yīng)疫苗株測(cè)定HI抗體，同時(shí)將免疫雞連同條件相同的對(duì)照雞，分別以鼻腔途徑感染選擇的H9N2亞型流行株雞胚尿囊液0.1 mL(含106EID50)。攻毒后第5 d采集喉頭和泄殖腔拭子進(jìn)行病毒分離，病毒分離陰性樣品則盲傳1代，每只雞均以喉頭和泄殖腔拭子的排毒總數(shù)作為其最終的排毒結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 抗原性分析 HI試驗(yàn)結(jié)果表明，我國(guó)分離的H9N2亞型AIV早期分離株CK/GD/6/97(GD6)、DK/NJ/2/97(NJ2)、CK/BJ/8/98(BJ8)和 CK/HB/31/00(HB31)血清對(duì)2008年分離株的HI抗體效價(jià)相差8 log2左右，抗原性存在較大差異；CK/HuN174/08、CK/SD/2CZ/08、CK/FJ/136/04和 CK/GX/10/99毒株與 2008年其他毒株約相差2 log2～4 log2，抗原性略有差別；2008年分離的大部分毒株間的抗原性比較接近，HI交互抗體均在10 log2左右(表2)。綜合考慮毒株的分離時(shí)間、地點(diǎn)、抗原性變化以及在一定區(qū)域分離的流行株數(shù)量等因素，本研究選取CK/HuN/174/08、CK/HuN/33/08、CK/SD/2CZ/08、CK/ZJ/17/08、CK/FJ/521/08和CK/FJ/560/08株共6個(gè)毒株進(jìn)行免疫效力試驗(yàn)研究。

表2 H9N2亞型禽流感病毒抗原性分析Table 2 Antigentic analysis of H9N2 subtype influenza virus

2.2 HA基因同源率比較 包括疫苗株在內(nèi)的2008年分離的8株病毒HA基因核苷酸同源率在93.2%～98.6%之間，而CK/SH/10/01毒株與這8株病毒的同源率僅在91.9%～93.5%之間。

2.3 效檢用病毒株EID50測(cè)定 測(cè)定結(jié)果，CK/HuN/33/08、 CK/HuN/174/08、 CK/FJ/521/08、 DK/FJ/560/08、CK/ZJ/17/08、CK/SD/2CZ/08、DK/FJ/22/08、CK/SC/83/08和GS/JS/106/08株每0.1 mL的病毒含量 依 次 分 別 為 109.16EID50、 108.38EID50、 108.57EID50、108.50EID50、 108.69EID50、 108.13EID50、 108.38EID50、108.79EID50和108.57EID50。

2.4 候選疫苗株對(duì)SPF雞的致病性 候選疫苗毒株 CK/HuN/33/08、 CK/HuN/174/08、 CK/FJ/521/08、DK/FJ/560/08、CK/ZJ/17/08和CK/SD/2CZ/08感染雛雞后均不出現(xiàn)死亡或明顯異常反應(yīng)。

2.5 病毒株的穩(wěn)定性 6株病毒在SPF雞胚連續(xù)傳了15代，所有代次病毒均無(wú)致病性；HA效價(jià)均比較穩(wěn)定，除 DK/FJ/560/08、CK/ZJ/17/08毒株在 9 log2左右以外，其余毒株均在10 log2左右。

2.6 滅活苗免疫效果試驗(yàn)

2.6.1 免疫抗體檢測(cè) 6株病毒滅活苗免疫后，針對(duì)目前使用的H9抗原的平均HI抗體滴度在9.33 log2～11.271 log2之間；針對(duì)疫苗株本身抗原的平均HI抗體滴度在10.35 log2～11.81 log2之間，表明各毒株均具有良好的免疫原性，免疫后能產(chǎn)生較高滴度的HI抗體(表3)。

表3 疫苗免疫21 d時(shí)HI抗體滴度Table 3 HI antibody titers after 21 day's vaccination

2.6.2 攻毒保護(hù)性研究 在所有病毒株分別以106EID50攻毒后，CK/FJ/521/08滅活疫苗免疫雞對(duì)同源毒株攻毒后有大量的病毒排泄，排毒數(shù)為7/8；對(duì)異源毒株的攻毒后也有大量排毒，最低為4/8，最高為 7/8；CK/SD/2CZ/08、DK/FJ/560/08和 CK/ZJ/17/08滅活疫苗對(duì)同源毒株攻擊有相當(dāng)程度的排毒，排毒數(shù)分別為3/10、3/8和4/8；對(duì)異源毒株的攻擊同樣有不同程度的排毒出現(xiàn)，而且最高總排毒數(shù)為5/8；CK/HuN/174/08和CK/HuN/33/08滅活疫苗對(duì)同源毒株100%保護(hù)，免疫雞均無(wú)排毒，對(duì)異源毒株也有良好的保護(hù)，其中用CK/HuN/33/08、CK/ZJ17/08、 CK/SD/2CZ/08、 GS/JS/106/08、 CK/SC/83/08 和DK/FJ/22/08株攻毒后，CK/HuN/174/08滅活疫苗免疫雞的排毒數(shù)分別為 0/9、1/10、2/10、3/9、2/9、1/9， 用 CK/HuN/174/08、 CK/ZJ17/08、 CK/FJ/521/08、 DK/FJ/560/08、 GS/JS/106/08、 CK/SC/83/08 和DK/FJ/22/08毒株攻毒后，CK/HuN/33/08滅活疫苗免疫雞的排毒數(shù)分別依次為0/8、1/8、1/8、2/7、3/9、2/10和2/9(表4)。上述結(jié)果表明，CK/HuN/174/08和CK/HuN/33/08毒株滅活疫苗不僅可以抵御同源毒株的攻擊，而且可以有效抵御異源毒株的攻擊。

表4 不同毒株疫苗攻毒結(jié)果Table 4 The challenge results of different vaccine

3 討 論

自90年代中期我國(guó)分離到第一株H9N2亞型AIV后，該亞型病毒一直在我國(guó)家禽中傳播蔓延，始終困擾著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。郭元吉等報(bào)道H9N2亞型病毒可感染雞并可以導(dǎo)致雞發(fā)病和死亡，死亡率可以達(dá)到10%～20%[8]。但李呈軍等研究發(fā)現(xiàn)，27株H9N2亞型分離株分別鼻腔感染SPF雞后，均未出現(xiàn)明顯臨床癥狀，也未出現(xiàn)死亡[6]。本研究中6株2008年分離的病毒接種SPF雞后，也未出現(xiàn)臨床發(fā)病或死亡現(xiàn)象。究其原因可能是實(shí)驗(yàn)室負(fù)壓隔離器內(nèi)環(huán)境純凈，試驗(yàn)雞不受其他疫病的干擾，無(wú)并發(fā)或繼發(fā)癥出現(xiàn)，而感染H9N2亞型AIV的現(xiàn)地家禽常由于環(huán)境不良或繼發(fā)感染細(xì)菌可出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀。國(guó)外有研究報(bào)道，與葡萄球菌或嗜血桿菌同時(shí)感染時(shí)，H9N2亞型AIV對(duì)雞的致病性增加[9]，另外，有研究報(bào)道我國(guó)的H9N2亞型禽流感一直存在變異與進(jìn)化[10]。因此，H9N2亞型AI對(duì)現(xiàn)地生產(chǎn)具有潛在的威脅，應(yīng)重視對(duì)該病的防制。

本研究對(duì)分離株的抗原性和HA基因序列分析顯示，早期分離株CK/GD/6/97、CK/BJ/8/98、DK/NJ/2/97和CK/HB/31/00的血清與2008年分離株抗原性差異大；2008年分離株中，除CK/HuN174/08和CK/SD/3XZ/08等個(gè)別病毒株的抗原性略有差異外，其余病毒株的抗原性比較接近。比較HA基因核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)2008年8病毒株間的HA基因同源率較高(93.2%～98.6%)，與 2001年分離株CK/SH/10/01病毒HA核苷酸序列同源率均較低(91.9%～93.1%)。這些研究結(jié)果表明，我國(guó)2008年分離的H9N2亞型AIV基因與早期病毒基因同源率較低，抗原性差異大，同一年代不同地域的病毒大多具有較近的親緣關(guān)系，但也有特殊病毒株的存在。

當(dāng)前我國(guó)有多個(gè)廠家研制生產(chǎn)的10多株H9N2亞型AI系列滅活疫苗同時(shí)應(yīng)用，為控制我國(guó)H9N2亞型AI發(fā)揮了重要作用。然而，本研究室在近2年的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，H9亞型HI抗體較高的免疫雞仍然攜帶H9亞型AIV，由此推斷目前應(yīng)用的AI滅活疫苗中可能存在不能有效阻止免疫雞排毒的疫苗。本研究對(duì)2008年分離的6株H9N2亞型AIV進(jìn)行免疫效力研究，結(jié)果表明，CK/HuN/174/08和CK/HuN/33/08滅活疫苗免疫雞不僅能夠完全抵御同源毒株的攻擊，而且同時(shí)對(duì)異源毒株攻擊也產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)。因此這2株病毒可作為理想的疫苗候選株。

本研究同時(shí)表明并非所有H9N2亞型分離株都適用于研制滅活疫苗。本實(shí)驗(yàn)中選擇的6株病毒滅活疫苗免疫SPF雞后均能夠產(chǎn)生10 log2左右的HI抗體滴度，然而，所選毒株中CK/FJ/521/08滅活疫苗免疫雞對(duì)同源毒株和異源毒株的攻擊均有大量排毒，總排毒最高為 7/8；CK/SD/2CZ/08、DK/FJ/560/08和CK/ZJ/17/08毒株滅活疫苗對(duì)同源毒株和異源毒株的攻擊，均只能提供部分保護(hù)。因此，只有對(duì)H9N2亞型AIV分離株進(jìn)行大量的分析和免疫效果評(píng)估才能確定其是否適合作為滅活疫苗種毒株。

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