李 政 李 燕 陶興無 余鳳云

阿美拉霉素又稱卑霉素、肥拉霉素。它是由綠色產(chǎn)色鏈霉菌 Tü57（Streptomyces viridochromogenes Tü57）發(fā)酵產(chǎn)生的正糖霉素族(orthosomycin)寡糖類多組分的抗生素[1]。難溶于水、吡啶、乙酸，易溶于丙酮、二氯甲烷等有機(jī)溶劑。其主要應(yīng)用于畜牧業(yè)，作為飼料添加劑使用，能顯著提高豬、肉雞等動物的平均日增重和飼料報酬，市場應(yīng)用前景廣闊。目前國內(nèi)研究多處于菌種選育階段，未進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。

在菌種選育過程中，好的篩選方法至關(guān)重要，而菌種發(fā)酵液抗生素產(chǎn)量的測定更是重中之重。目前國內(nèi)所報道的阿美拉霉素的含量檢測方法主要有高效液相法[2]和生物監(jiān)測法[3-4]，但高效液相法成本較高，應(yīng)用于菌種大規(guī)模篩選時很不劃算，而生物監(jiān)測法周期長，操作繁瑣，受溫度、濕度及操作人員等因素的影響，往往出現(xiàn)較大的誤差。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)阿美拉霉素在212 nm處有較大吸收的特點(diǎn)，建立了以薄層-紫外分光光度計檢測阿美拉霉素含量的方法，該法較為簡單、快捷、準(zhǔn)確，成本低，尤其適合于阿美拉霉素菌種的大量篩選及無高效液相條件下阿美拉霉素相關(guān)產(chǎn)品的含量檢測。

1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

uv-vis 8500型紫外分光光度計、eppendorf centrifuge 5417R臺式高速冷凍離心機(jī)、254紫外分析儀、對照品(美國禮來公司提供)。

微量移液器、HF254硅膠板、展層缸、甲醇、二氯甲烷。

2 實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果

2.1 對照品溶液的配置

精密稱取干燥恒重的阿美拉霉素對照品50mg置于50 ml的容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋到刻度，制成1mg/ml的對照品溶液，儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試品溶液的制備

阿美拉霉素是一種親脂性寡糖類物質(zhì)，在水中的溶解度極低，在發(fā)酵液中絕大部分存在于菌體的細(xì)胞周質(zhì)空間。因此本實(shí)驗(yàn)室將發(fā)酵液離心后直接去上清液，60℃條件下將菌體干燥至恒重。取菌體粉末5 g置于50 ml的離心管中，加入10 ml二氯甲烷振搖提取30 min，離心取上清液儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 阿美拉霉素波長的選擇

精密吸取阿美拉霉素對照品溶液1 ml，以甲醇為稀釋液稀釋到20 μg/ml，以甲醇為空白對照，在uvvis 8500型紫外分光光度計上掃描吸收光譜圖，掃描范圍為180.0～400.0 nm，得知阿美拉霉素在212.0 nm和289.0 nm處有吸收峰，212.0 nm處吸收峰最大，則選擇212.0 nm為測定波長，見圖1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以1mg/ml的阿美拉霉素對照品溶液為母液，精確配置濃度為 10、20、30、40、50、60 μg/ml的對照品梯度溶液。以甲醇為空白溶液，置于紫外分光光度計下，在212.0 nm處檢測吸光度，以濃度（x）為橫坐標(biāo)，以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，阿美拉霉素在 10～60 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖2。

圖1 阿美拉霉素對照品波譜掃描圖

圖2 阿美拉霉素對照品曲線

2.5 阿美拉霉素提取液樣品的薄層層析及含量測定

吸取阿美拉霉素供試品與對照品各20 μl，同時在一塊HF254硅膠板上點(diǎn)樣，以二氯甲烷：甲醇（9：1）為展開劑展開，Rf值約為0.4。將硅膠板吹干后，在254紫外分析儀下觀察并畫出有效斑點(diǎn)范圍。用鋼匙刮取上述斑點(diǎn)于容量瓶中，加4 ml的甲醇超聲洗脫15 min，過濾，濾液于10 ml的容量瓶中，用甲醇定容。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定吸光度并計算含量。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試品溶液20 μl點(diǎn)樣于薄層板上，按2.5的方法于212.0 nm波長條件下連續(xù)測定5次吸光度，計算RSD值得0.74%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試品溶液20 μl點(diǎn)樣于薄層板上，按2.5 節(jié)的方法于 212 nm 波長條件下于 0、1、2、3、4、5、6 h測定吸光度，計算RSD值得0.85%。說明樣品在6 h內(nèi)吸光度穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

在同一塊硅膠板下端點(diǎn)樣，第1個點(diǎn)點(diǎn)上已知阿美拉霉素含量的發(fā)酵液供試品20 μl，然后在第2個點(diǎn)點(diǎn)上已知濃度的對照液20 μl，第3、4、5個點(diǎn)先點(diǎn)上20 μl的已知阿美拉霉素含量的發(fā)酵液樣品，再分別點(diǎn)上10、15、20 μl已知濃度的對照品，展層后按樣品測定法測定各樣品的吸光度，重復(fù)測3次，然后換算成含量，計算回收率?；厥章?混合液的含量/(混合液含量+已知發(fā)酵液樣品含量)。結(jié)果表明本方法回收率良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)果與討論

本文首次提出用薄層-紫外分光光度法檢測阿美拉霉素含量的方法適合于在實(shí)驗(yàn)室無高效液相條件下對阿美拉霉素發(fā)酵液及其樣品的含量分析檢測。鑒于目前國內(nèi)阿美拉霉素菌種的產(chǎn)量還不高，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室還停留在高產(chǎn)菌株的篩選階段，通過高效液相方法大規(guī)模的檢測各個菌種的發(fā)酵產(chǎn)量，成本高，設(shè)備復(fù)雜，檢測耗時長。本方法可以簡便、快捷，相對準(zhǔn)確地測定菌種發(fā)酵產(chǎn)量，且重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率良好，尤其適合應(yīng)用于阿美拉霉素高產(chǎn)菌的大規(guī)模篩選。

本方法容易受薄層厚度、均勻程度、點(diǎn)樣量的準(zhǔn)確性等因素影響，因此操作過程中要嚴(yán)格控制條件，方可保證較高的精確度。

[1]Weitnauer G,Mühlenweg A,Trefzer A,et al.Biosynthesis of the orthosomycin antibiotic avilamycin Adeductions from the molecular analysis of the avi biosynthetic gene cluster of Streptomyces viridochromogenes Tü57 and production of new antibiotics[J].Chem.Biol.,2001，8(6):569-581.

[2]張秀英.阿維拉霉素預(yù)混劑的含量測定[J].中國獸藥雜志,2000,35(3):21-23.

[3]靳亮,童應(yīng)凱,王澤立,等.卑霉素高產(chǎn)菌株的選育[J].中國抗生素雜志,2006,5(31):303-305.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典二部 [M].2005年版.附錄Ⅺ.