鼻咽癌組織中 P-Akt的表達(dá)及其臨床意義

李宇清,楊惠玲

鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma,NPC)是嚴(yán)重威脅人類健康的一種惡性腫瘤。中國是鼻咽癌的高發(fā)國之一,我國的總發(fā)病率約占全世界的 80%,南方發(fā)病率高于北方,尤其是廣西、廣東、福建、湖南等省,發(fā)病率高的地方可達(dá)到 15/10萬 ～30/10萬。由于鼻咽癌的發(fā)病部位隱蔽,早期癌往往沒有癥狀,鼻咽癌患者自己很難發(fā)現(xiàn),直至發(fā)現(xiàn)一些癥狀到醫(yī)院檢查時(shí),80%的患者已是晚期。鼻咽癌的治療效果與臨床分期存在很大關(guān)系[1],Ⅰ期患者在放射性治療之后 5年生存率可達(dá)到 90%以上;而晚期患者的 5年生存率僅 8%～10%[2]。為了提高鼻咽癌的診治水平,建立快捷有效的檢測(cè)方法,尋找能夠用于早期診斷、判斷預(yù)后和治療觀察,且具有高靈敏度和特異度的標(biāo)志物十分必要。本研究從蛋白水平檢測(cè)腫瘤相關(guān)分子P-Akt在鼻咽癌組織中的表達(dá),明確其在鼻咽癌組織和非腫瘤鼻咽組織中的表達(dá)差異。通過對(duì)此蛋白分子與鼻咽癌臨床病理因素相關(guān)性研究,探討其在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 病例入選標(biāo)準(zhǔn) 病例選取的條件包括:患者術(shù)前均未行放、化療,術(shù)后均有明確的病理學(xué)診斷;免疫組化實(shí)驗(yàn)之前,HE染色片請(qǐng)資深病理教授確診為鼻咽癌,組織學(xué)分類明確;鼻咽癌的臨床分期檢查至少要包括:常規(guī)體格檢查、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查、胸部 X線檢查,腹腔 B超,必要時(shí)頭頸部 MRI和 (或)CT、全身放射性核素骨骼掃描和內(nèi)鏡檢查;有完整的術(shù)后隨訪資料。

1.2 一般資料 篩查廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科 2002—2003年鼻咽癌的患者資料,從中選擇了符合上述條件的 60例鼻咽癌患者;另外選取同期行病理活組織檢查的 30例非腫瘤 (鼻咽慢性炎癥)患者做對(duì)照。鼻咽癌組中,男 44例,女16例,男女比例為 2.75∶1;年齡 17～87歲,平均 46.0歲。對(duì)照組中男 19例,女11例,男女比例為 1.73∶1;年齡 18～79歲,平均 44.3歲。兩組患者性別、年齡間有均衡性。

根據(jù) 1991年 WHO鼻咽癌組織學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)對(duì)鼻咽癌患者進(jìn)行組織學(xué)分型,60例均為非角化型鱗狀細(xì)胞癌 (non-keratinizing squamous cell carcinoma),其中分化型 (differentiated)49例,未分化型(undifferentiated)11例。

1.3 鼻咽癌 TNM分期 2003版美國腫瘤聯(lián)合會(huì) (American joint committee on cancer,AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟 (International union against cancer,UICC)鼻咽癌 TNM分期法:T1(腫瘤局限于鼻咽腔內(nèi))29例,T2〔腫瘤侵犯鼻腔和 (或)口咽,T2a無咽旁間隙侵犯,T2b有咽旁間隙侵犯〕9例,T3〔腫瘤侵犯顱底骨質(zhì)和(或)鼻旁竇〕17例,T4(腫瘤侵犯顱內(nèi)、腦神經(jīng)、下咽、顳下窩、眼眶、咀嚼肌)5例;N0(無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)21例,N1(單側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,最大徑≤6 cm,位于鎖骨上窩以上部位)22例,N2(雙側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,直徑≤6 cm,位于鎖骨上窩以上部位)15例,N3(頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:a,直徑 ＞6 cm;b,鎖骨上窩轉(zhuǎn)移)2例;M0(無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)58例,M1(有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)2例。

根據(jù) 2003版 AJCC和 UICC鼻咽癌TNM分期法,將鼻咽癌分為 4期:T1N0M0為Ⅰ期;Ⅱ期包括Ⅱa(T2aN0M0)和 Ⅱb(T1N1M0、 T2aN1M0、 T2bN0～1M0);T1N2M0、T2a～2bN2M0、T3N0～2M0為 Ⅲ期 ;Ⅳ期包括 Ⅳ a期 (T4N0～2M0)、 Ⅳ b期(T1～4N3M0)和 Ⅳc期 (T1～4N0～3M1)。本組鼻咽癌患者中,Ⅰ期7例,Ⅱ期 20例,Ⅲ期 25例, Ⅳ期 8例。

1.4 主要試劑 (1)P-Akt抗體,鼠單抗,Cell Signaling公司;(2)小鼠 /兔IgG濃縮型 SABC免疫組化染色試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司;(3)山羊 IgG濃縮型 SABC免疫組化染色試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司;(4)DAB顯色試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司。

1.5 方法 選擇鼻咽癌組癌組織石蠟標(biāo)本和對(duì)照組的鼻咽組織石蠟切片。采用鏈酶親和素 -生物素 -過氧化物酶連結(jié)法染色(strept avidin-biotin-enzyme complex,SABC法)進(jìn)行免疫組化檢驗(yàn)。然后由兩人雙盲法觀察切片,在 ×100倍鏡下觀察切片著色情況,隨機(jī)選取上下左右中 5個(gè)部位,分別在 ×400高倍鏡視野下計(jì)數(shù)。每個(gè)視野計(jì)數(shù) 200個(gè)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)。綜合 5個(gè)視野,計(jì)算平均值。

1.6 P-Akt陽性標(biāo)準(zhǔn)[3-4]P-Akt陽性著色為粗細(xì)不一的棕黃顆粒,主要定位于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中。免疫組化染色按陽性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞的比例進(jìn)行分級(jí):細(xì)胞質(zhì)著淡黃至黃色為弱陽性 (+),黃至棕黃色為陽性 (++),棕褐色為強(qiáng)陽性(+++)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料用百分率表示,采用 χ2檢驗(yàn);P-Akt蛋白與鼻咽癌各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組鼻咽組織 P-Akt表達(dá)水平比較鼻咽癌組織中,P-Akt表達(dá)陽性 21例,陽性率為 35.0%,主要定位于細(xì)胞質(zhì),部分細(xì)胞核也呈陽性反應(yīng);對(duì)照組鼻咽組織中無 P-Akt表達(dá),兩組鼻咽組織P-Akt陽性率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=13.70,P＜0.01)。

2.2 P-Akt表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系

2.2.1 P-Akt表達(dá)與腫瘤原發(fā)部位的病變范圍及周邊組織侵犯程度的關(guān)系 鼻咽癌按腫瘤原發(fā)部位的病變范圍和周邊組織侵犯程度分為 T1、T2、T3、T44個(gè)等級(jí),P-Akt在 T1、 T2、 T3、 T44個(gè)等級(jí)癌組織中的陽性率分別是 21%(6/29)、3/9、47%(8/17)和 4/5,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=9.17,P＜0.05)。

2.2.2 P-Akt表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

P-Akt在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (N0)和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (N1～N3)的鼻咽癌組織中陽性率分別為 24%(5/21)、36%(8/22)、40%(6/15)和 2/2,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.14,P＜0.05)。

2.2.3 P-Akt表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系P-Akt在無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 (M0)和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 (M1)的鼻咽癌組織中陽性率分別為46%(19/58)和 2/2,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (Z=2.72,P＜0.01)。

2.2.4 P-Akt表達(dá)與臨床分期的關(guān)系P-Akt在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期鼻咽癌組織中的陽性率分別是 1/7、25%(5/20)、44%(11/25)和 4/8,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (H=10.74,P＜0.05)。

2.2.5 P-Akt與組織病理學(xué)分型的關(guān)系

分化型和未分化型鼻咽癌組織 P-Akt陽性率分別為 41%(20/49)和 9%(1/11),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (Z=1.43,P＞0.05)。

2 討論

Akt是細(xì)胞質(zhì)中一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,早在 1977年由 Staal等[5]在研究一種反轉(zhuǎn)錄病毒 AKT8時(shí)發(fā)現(xiàn)。在 1991年作為蛋白激酶 C的同源物而被分離出來,因具有與蛋白激酶 A和蛋白激酶 C同源的序列,故又稱為蛋白激酶 B[6]。Akt包括 3個(gè)亞型:Akt1(PKBα)、 Akt2(PKBβ)和 Akt3(PKBγ),分別由位于染色體 14q32、19q13和 1q44的基因編碼,是一密切相關(guān)的同系物。它們?cè)诟鞣N組織中廣泛表達(dá),但在某些組織中表達(dá)具有特異性。

非磷酸化 Akt不具備生物學(xué)活性,因此 Akt必須經(jīng)過磷脂酰肌醇 -3激酶(phos-phoinositide 3-kinase,PI3K)/Akt信號(hào)途徑磷酸化而激活后才能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡。本研究用免疫組化方法檢測(cè)活化狀態(tài) P-Akt在鼻咽癌中的表達(dá)情況。Akt在 PI3K作用下發(fā)生活化即磷酸化,生成 P-Akt,PI3K/Akt信號(hào)通路參與很多重要生物學(xué)過程的調(diào)控,但其過度激活可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此,P-Akt水平的增加可導(dǎo)致 PI3K/AKT細(xì)胞生存通路的活化,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等。可見 PI3K/AKT信號(hào)通路失控與人體腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。而 AKT的活化形式 P-Akt是該通路起作用的關(guān)鍵,可見 P-Akt的高表達(dá)與腫瘤的產(chǎn)生和進(jìn)展有相關(guān)性[7]。

本研究結(jié)果顯示,鼻咽癌組織 PAkt表達(dá)陽性率為 35.0%,而在非腫瘤鼻咽組織中幾乎不表達(dá),說明 P-Akt在鼻咽癌組織中過表達(dá)。此外,本研究對(duì)臨床病理資料進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn) P-Akt與病理組織學(xué)分型無關(guān),但 P-Akt在鼻咽癌的表達(dá)與腫瘤原發(fā)部位的病變范圍和周圍侵犯情況有關(guān),與鼻咽癌是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及鼻咽癌的臨床分期有關(guān),淋巴結(jié)侵犯也對(duì) P-Akt在鼻咽癌中的表達(dá)有影響。提示 P-Akt可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),而且隨著腫瘤出現(xiàn)局部浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期由早期到晚期,P-Akt表達(dá)更為活躍,蛋白表達(dá)水平更高,提示 P-Akt蛋白與鼻咽癌的惡性程度和轉(zhuǎn)移進(jìn)展有關(guān)。可見 P-Akt蛋白有可能用于臨床鼻咽癌病情和預(yù)后的判斷。而 P-Akt蛋白表達(dá)陽性除了與鼻咽癌的原發(fā)灶情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)外,還與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān),這提示 Akt的活化與腫瘤的侵襲性關(guān)系更為密切,可能是 PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑過度激活干預(yù)腫瘤細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞存活和過度增殖,在腫瘤細(xì)胞惡性行為中發(fā)揮作用[8]。

綜上所述,P-Akt參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,P-Akt水平可能有助于臨床判斷鼻咽癌患者的預(yù)后,并有可能為鼻咽癌的治療提供新的靶點(diǎn)。有必要進(jìn)一步研究探討抑制過度激活的 PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能否對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有負(fù)性調(diào)控作用。

1 Sheng L,Shui Y,Shen L,et al.Effect of patient-related delay in diagnosis on the extent of disease and prognosis in nasopharyngeal carcinoma[J].Am J Rhinol,2008,22(3):317-320.

2 Shen C,Lu JJ,Gu Y,et al.Prognostic impact of primary tumor volume in patients with nasopharyngeal carcinoma treated by definitive radiation therapy[J].Laryngoscope,2008,118(7):1206-1210.

3 Liang J,Zubovitz J,Petrocelli T,et al.PKB/AKT phosphorylates p27,impairs nuclear import of p27 and opposes p27-mediated G1 arrest[J].Nat Med,2002,8(10):1153-1160.

4 Moreira JM,Ohlsson G,Rank FE,et al.Down-regulation of the tumor suppressor protein 14-3-3sigma is a sporadic event in cancer of the breast[J].Mol Cell Proteomics,2005,4(4):555-569.

5 Staal SP,Hartley JW,Rowe WP.Isolation of transforming murine leukemia viruses from mice with a high incidence of spontaneous lymphoma[J].Proc Natl Acad Sci USA,1977,74:3065-3067.

6 Jones PF,Jakubowicz T,Pitossi FJ,et al.Molecular cloning and identification of a serine/threonine protein kinase of the secondmessenger subfamily[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(10):4171-4175.

7 Cantley LC.The phosphoinositide 3-kinase pathway[J].Science,2002,296(5573):1655-1657.

8 Kim CS,Vasko VV,Kato Y,et al.AKT activationpromotes metastasis in a mouse model offollicular thyroid carcinoma[J].Endocrinology,2005,146(6):4456-4463.