金屬離子促進Gluconobacter oxydans高效合成2-酮基-L-古龍酸

紀凱, 劉杰, 秦蘇東, 劉立明, 陳堅

(1.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室;2.江蘇江山制藥有限公司,江蘇靖江 214500)

金屬離子促進Gluconobacter oxydans高效合成2-酮基-L-古龍酸

紀凱, 劉杰2, 秦蘇東2, 劉立明＊1, 陳堅1

(1.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室;2.江蘇江山制藥有限公司,江蘇靖江 214500)

根據(jù)Gluconobacter oxy dans合成2-酮基-L-古龍酸(2-KL G)代謝途徑采用單因素實驗研究了6種金屬離子對細胞生長和2-KL G的影響,在此基礎上,對促進細胞生長或產(chǎn)酸的Mg2+、Mn2+、Fe3+建立多元二次方程模型,得到上述3種金屬元素的最佳濃度為Fe3+0.21 mmol/L, Mn2+9.98 mmol/L和Mg2+4.23 mmol/L。在這一最優(yōu)組合下,2-KL G產(chǎn)量達到65.1 g/L,與優(yōu)化前比較,提高了144.4%。

Gluconobacter oxy dans;金屬離子;2-酮基-L-古龍酸

維生素C是人體必需的營養(yǎng)元素之一,廣泛應用于醫(yī)藥、食品、飼料及化妝品中。由國內(nèi)開發(fā)的維生素C“二步工藝”是目前維生素C生產(chǎn)方法中應用最廣和最具吸引力的工藝之一[1]。維生素C二步發(fā)酵工藝采用G.ox y dans和B.megaterium為生產(chǎn)菌株,催化L-山梨糖為2-酮基-L-古龍酸(2-KL G)。在這一過程中,L-山梨糖脫氫酶(SDH)和L-山梨酮脫氫酶(SNDH)是催化這一轉(zhuǎn)化的關鍵酶。Sugisawa[2]在前期研究中發(fā)現(xiàn),一定濃度的Fe3+和Mg2+和Ca2+能分別有效提高SDH和SNDH的活性,但Cu2+則抑制SNDH活性(圖1)。培養(yǎng)基中過量的Cu2+導致發(fā)酵過程中β.megaterium自溶,從而影響G.oxy dans發(fā)酵生產(chǎn)2-KL G的產(chǎn)量[3],而添加Mg2+和Mn2+則能有效抑制這一現(xiàn)象[4]。

本研究在分析不同金屬離子對G.ox y dans代謝途徑影響的基礎上,采用單因素實驗考察了Fe3+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+和Zn2+6種金屬離子對2-KL G發(fā)酵的影響,選取對細胞生長和產(chǎn)酸有顯著影響的3種離子(Fe3+、Mg2+、Mn2+),通過建立數(shù)學模型[5-6],從而得到3種金屬離子的最佳組合,促進2-KL G產(chǎn)量的提高。

圖1 氧化葡萄糖酸桿菌中2-酮基-L-古龍酸代謝途徑Fig.1 The metabolic pathway of 2-keto-L-gulonic inGluconobacter oxydans

1 材料與方法

1.1 菌種

Gluconobacteroxy dans(小菌),B acillus megaterium(大菌)。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:L-山梨糖2.0%(單獨滅菌)、牛肉膏0.3%、玉米漿0.15%、尿素0.1%、氯化鈣0.1%、氯化鎂0.02%、磷酸二氫鉀0.1%;p H值6.7,121℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:L-山梨糖8.0%(單獨滅菌)、玉米漿0.2%、尿素1.0%、氯化鈣0.5%、磷酸氫二鉀0.1%;p H值7.0,121℃滅菌15 min。

1.3 培養(yǎng)方法

G.oxy dans種子培養(yǎng):750 mL三角瓶裝液量75 mL,吸取0.5 mL甘油管菌懸液于三角瓶中,控制初始p H值6.8,30℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)32 h。

B.megaterium種子培養(yǎng):750 mL三角瓶裝液量75 mL,吸取0.5 mL甘油管菌懸液于三角瓶中,控制初始p H 6.8,30℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)8～9 h。

發(fā)酵培養(yǎng):750 mL三角瓶裝液量75 mL,B.megaterium接種量為體積分數(shù)5%,控制初始p H 6.8～7.0,30℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)菌體至穩(wěn)定期接入G.oxydans種子培養(yǎng)液,接種量為體積分數(shù)5%,繼續(xù)培養(yǎng)72 h。每個樣品做3個平行樣。

1.4 分析方法

1.4.1 2-KL G濃度的測定:改進的碘量法[7]取樣品2 mL于10 mL比色管中,加入2 mL 7 mol/L H2SO4,100℃條件下水浴30 min,洗入500 mL的三角瓶,加4～5滴0.1 mol/L的淀粉溶液作為指示劑,用0.1 mol/L的標準碘液滴定至藍色為終點。2-KL G的含量(mg/mL)=7.691 6×耗碘量(mL)。1.4.2 山梨糖濃度的測定 蒽酮硫酸法[8]。

1.4.3 菌體干重測定 取10 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中,2 200 r/min離心10 min沉淀大菌與雜質(zhì),加入1 mol/L稀鹽酸洗滌沉淀兩次。上清液倒入另一50 mL離心管,10 000 r/min離心20 min,傾去上清液,80℃烘干至恒重后稱重。

1.5 響應面法實驗設計

根據(jù)單因素實驗選取對菌體生長和2-KL G產(chǎn)量有重要影響的3種金屬離子(Fe3+、Mg2+、Mn2+),采用3因素3水平的Box-Behnken中心組合實驗設計,對這3種金屬離子重新編碼和進行水平標注(表2)。表3列出了Box-Behnken實驗設計下B.megaterium和G.ox y dans混合培養(yǎng)生成2-KL G的情況,其中第13-15次實驗為3次重復的中心點實驗,用于考察模型的誤差。實驗中各模型通過最小二乘法擬合二次多項方程可表達為:Y=β0為響應值(2-KL G合成量),β0為常數(shù)項,βi、βij、βii為回歸系數(shù),χi、χj(i=1,4;j=1,4;i≠j)為自變量編碼值。多項式模型方程擬合的性質(zhì)由確定系數(shù)R2表達,其統(tǒng)計學上的顯著性由F值檢驗,采用SAS典型性分析預測生物合成2-KL G的最大值以及獲得最大值的條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 金屬離子對2-KLG發(fā)酵的影響

6種金屬離子(Fe3+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+和Zn2+)對2-KL G合成的影響如圖2所示,對G.oxy dans和B.megaterium生長的影響如圖3所示。與未添加金屬離子的對照組比較,添加Fe3+(0.25mmol/L)、Mg2+(8.3mmol/L)、Mn2+(13.25 mmol/L)能有效地提高2-KL G的產(chǎn)量。當添加0.25 mmol/L Fe3+、8.3 mmol/L Mg2+、13.25 mmol/L Mn2+時,2-KL G產(chǎn)量提高了22.3%、39.4%、63.6%。然而,在培養(yǎng)基中添加一定量的Cu2+或Zn2+則明顯抑制細胞生長和降低2-KL G產(chǎn)量。Ni2+雖然在一定程度上促進了大菌細胞生長,但2-KL G產(chǎn)量僅為對照組的49.4%。

圖2 金屬離子對G.oxydans發(fā)酵生產(chǎn)2-K LG的影響Fig.2 Effect of metal ions on 2-K LG production by G.oxydans

圖2 金屬離子對G.oxydans和B.megaterium生長的影響Fig.2 Effect of metal ions on cell growth

對細胞生長和2-KL G產(chǎn)量進一步分析發(fā)現(xiàn): (1)與對照組比較,Mn2+或Mg2+的添加降低了單位細胞生產(chǎn)2-KL G的能力,且單位細胞生產(chǎn)2-KL G的能力隨著培養(yǎng)基中Mn2+或Mg2+濃度的增加而逐漸下降;(2)而Fe3+的添加(0～0.25 mmol/ L)則促進了單位細胞生產(chǎn)2-KL G能力的提升,當培養(yǎng)基中Fe3+濃度為0.25 mmol/L時,單位細胞產(chǎn)酸量達到最大值(40.6 g/g),與對照比較,提高了35.3%。上述結(jié)果表明,Mn2+、Mg2+雖可促進細胞生長、阻止B.megaterium菌體自溶,但弱化了G.oxy dans代謝功能;而一定濃度的Fe3+則強化了G.oxy dans發(fā)酵生產(chǎn)2-KL G的代謝能力[2]。

2.2 金屬元素影響2-KLG合成的多元二次模型方程

前期研究表明,Mn2+或Mg2+能促進細胞生長,但不促進產(chǎn)酸能力的提升;而添加Fe3+則能促進2-KL G的合成。結(jié)合G.oxydans中2-KL G的代謝途徑(圖1),優(yōu)化培養(yǎng)基中Mn2+、Mg2+、Fe3+濃度(表1),以進一步提高2-KL G產(chǎn)量。上述不同金屬離子濃度組合對2-KL G濃度的影響如表2所示,當培養(yǎng)基中Mn2+、Mg2+、Fe3+濃度分別為6.63、4.1和0.25 mmol/L(表2,實驗5)時2-KL G產(chǎn)量達到最大值(63.9 g/L);而Mn2+、Mg2+、Fe3+濃度為13.25、12.5、0.05 mmol/L時(表2,實驗4) 2-KL G產(chǎn)量為最小值(30.0 g/L)。對模型方程進行F值檢驗(表3,p<0.000 1,R2=0.992 4),表明總模型方程能解釋99.24%的2-KL G濃度變化,總變異中僅0.76%不能由該模型解釋,很好地反應了真實實驗數(shù)據(jù)。

表1 中心組合實驗因素水平表Tab.1 Factors and levels of Box-Benhnken

表2 Box-Benhnken實驗設計方案和結(jié)果Tab.2 Design and experimental results of Box-Benhnken

表3 模型回歸方程方差分析Tab.3 V ariance analysis(ANOVA)for regression equation of model

對實驗數(shù)據(jù)進行方程擬合并進行方差分析,結(jié)果較顯著,因此可用回歸方程代替實驗值進行分析(表4)。采用多項式回歸對實驗數(shù)據(jù)進行擬合,得二次多項式方程:

2.3 2-KLG合成模型方程分析

保持培養(yǎng)基中Mn2+(x3)濃度為恒值,Fe3+(x1)和Mg2+(x2)對2-KL G產(chǎn)量的影響如圖4所示;相應地,分別維持Fe3+(x1)、Mg2+(x2)恒定時,其他兩種金屬元素濃度變化對2-KL G產(chǎn)量的影響如圖5和圖6所示。在等高線圖中,極值條件需出現(xiàn)在圓心處。分析圖3-圖5發(fā)現(xiàn),Fe3+與Mn2+的交互影響最為顯著,表現(xiàn)為等高曲線陡峭,Fe3+與Mg2+次之,而Mg2+與Mn2+的交互影響最弱,表現(xiàn)為等高曲線較為平滑。這一結(jié)果說明Fe3+對2-KL G產(chǎn)量影響最大,而Mg2+與Mn2+則相對較小。

2.4 促進2-KLG合成的最佳金屬元素組合

由于模型方程(2)中x1、x2、x3的二次項系數(shù)為負,拋物線開口向下,因此方程有最大值(65.10 g/ L)。采用SAS軟件對方程進行嶺脊分析,得到上述3個顯著因素的最優(yōu)組合:Fe3+0.21 mmol/L、Mn2+9.98 mmol/L和Mg2+4.23 mmol/L。以上述最優(yōu)的金屬元素組合進行實驗,2-KL G產(chǎn)量分別達到65.0 g/L、65.2 g/L和65.1g/L,3次重復實驗的平均值為65.1 g/L,接近預測值。表明模型方程真實可行,很好地預測了實驗結(jié)果。

表4 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗和結(jié)果Tab.4 Significance test and results for regression coefficients of model

圖4 Y=f(x1,x2)的響應面和等高線圖Fig.4 Responsive surfaces and contour ofY=f(x1,x2)

圖5 Y=f(x2,x3)的響應面和等高線圖Fig.5 Responsive surfaces and contour ofY=f(x2,x3)

圖6 Y=f(x1,x3)的響應面和等高線圖Fig.6 Responsive surfaces and contour ofY=f(x1,x3)

3 結(jié) 論

在分析金屬離子G.oxydans合成2-KL G代謝途徑的基礎上,采用單因素實驗分析了Fe3+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+和Zn2+6種金屬離子對細胞生長和2-KL G合成的影響,發(fā)現(xiàn)僅Fe3+、Mn2+和Mg2+能促進細胞生長或產(chǎn)酸。在此基礎上,以2-KL G產(chǎn)量為目標函數(shù),建立二次多項式數(shù)學模型,尋求培養(yǎng)基中Fe3+、Mg2+、Mn2+最佳濃度。發(fā)現(xiàn)當Fe3+、Mg2+、Mn2+濃度分別為0.21 mmol/L、4.23 mmol/L和9.98 mmol/L時,2-KL G產(chǎn)量達到65.1 g/L,與優(yōu)化前比較,提高了144.4%。

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(責任編輯:楊萌)

Enhancement of 2-keto-L-gulonic production in Gluconobacter oxydansThrough Feeding Metalions

J I Kai1, LIU Jie2, QING Su-dong, ,LIU Li-ming＊1,CHEN Jian1,2
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;
2.Jiangsu Jiangshan Pharmaceutical Co.,Ltd.Jingjiang 214500,China)

To further increase the production of 2-keto-L-gulonic acid byGluconobacter oxy dans,the effects of six different metal ions were determined,based on the analysis of L-Sorbosone pathway.It was found thatFe3+,Mg2+,Mn2+can enhance the cell growth and 2-KL G production.Then,an optimum concentration of those three metal ions was achieved by developing a multivariate quadratic equation:Fe3+0.21 mmol/L,Mn2+9.98 mmol/L,and Mg2+4.23 mmol/L.By using the optimum combination,the production of 2-keto-L-gulonic reached at 65.1 g/L,which is 144.4%higher than that of the control.

Gluconobacter oxy dans,metal ions,2-keto-L-gulonic

S 567

:A

1673-1689(2010)01-0139-06

2008-07-10

國家863計劃項目(2006AA020303);國家“十一五”科技支撐計劃項目(2007BAI46B02)。

＊通訊作者:劉立明(1976-),男,安徽宿松人,工學博士,副教授,主要從事微生物細胞生理功能工程研究。Email:mingll@jiangnan.edu.cn