王大紅, 陶文沂

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

抗腫瘤物質(zhì)的研究

王大紅, 陶文沂＊

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

利用MTT法研究了粘細(xì)菌StigmatellaWXNXJ-B代謝產(chǎn)物對(duì)Hep G2腫瘤細(xì)胞的抑制作用,考察了一些理化因素對(duì)代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響并定性分析了代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明,StigmatellaWXNXJ-B菌株產(chǎn)生的活性物質(zhì)能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),抗腫瘤活性物質(zhì)產(chǎn)生的最佳發(fā)酵時(shí)間為7 d。大孔樹脂HPD100、XAD16和DA201對(duì)活性物質(zhì)的吸附效果較好,該活性物質(zhì)在12 h的自然光和紫外光照射下、在溫度不高于70℃和p H 3～10之間穩(wěn)定性好,代謝產(chǎn)物中含有內(nèi)酯類、苷類和甾體類物質(zhì)。

粘細(xì)菌WXNXJ-B;抗腫瘤活性;穩(wěn)定性;定性分析

粘細(xì)菌是最高等的原核生物類群,具有復(fù)雜的多細(xì)胞行為和形態(tài)發(fā)生,在細(xì)胞分化、發(fā)育和生物進(jìn)化研究中占有重要地位,如My xococcus是原核生物社會(huì)學(xué)行為研究的著名模式菌[1]。近年來,粘細(xì)菌作為一類可產(chǎn)生豐富次級(jí)代謝物的微生物類群日趨受到重視[2-3]。目前從粘細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)大約400多種生物活性物質(zhì),約占微生物來源總數(shù)的3.5%,僅在放線菌和芽孢桿菌之后,研究工作已涉及分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、生物技術(shù)及生物活性物質(zhì)等多個(gè)領(lǐng)域[4]。粘細(xì)菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)具有種類多(包括芳香族、雜環(huán)類、醌類、大環(huán)類、聚醚類、多烯類等)、結(jié)構(gòu)新、一株菌可以產(chǎn)生一種基本結(jié)構(gòu)的許多衍生物、菌株的特異性等特點(diǎn)。其獨(dú)特之處是粘細(xì)菌所產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)有許多是作用于真核細(xì)胞的,其抗腫瘤和抗真菌活性物質(zhì)的比例較高[5-6]。

在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)中,Epothilone[7]具有和Taxol相同的作用機(jī)制,被認(rèn)為是下一代抗腫瘤藥物;Soraphen[8]是一種廣譜抗真菌化合物,具有很大應(yīng)用前景的生物農(nóng)藥。作者所在實(shí)驗(yàn)室分離、保存6株體外抗腫瘤活性很高的粘細(xì)菌,并且從其中一株Sorangium cellulosumWXNXJ-C中分離出一種新的大環(huán)內(nèi)酯類抗腫瘤化合物——福鴿霉素(Phoxalone)[9]。作者對(duì)另一株粘細(xì)菌StigmatellaWXNXJ-B菌株產(chǎn)生抗腫瘤物質(zhì)的活性以及穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 粘細(xì)菌StigmatellaWXNXJ-B,作

者所在研究室分離、鑒定和保存[10]。

1.1.2 培養(yǎng)基(組分g/L)

1)種子培養(yǎng)基:土豆淀粉10.0,葡萄糖2.0,酵母粉2.0,脫脂奶粉4.0,CaCl21.0,MgSO4·7H2O 1.0,Fe(III)-Na-EDTA 0.008。

2)發(fā)酵培養(yǎng)基:在種子培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加20 g大孔樹脂,甘油5 mL。

1.1.3 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基 10%小牛血清,90% RPMI1640,2 mol/L L-谷氨酰胺,100 U/mL青霉素和100 U/mL的鏈霉素。

1.1.4 腫瘤細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞Hep G2,江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院分子藥理研究室惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 粘細(xì)菌StigmatellaWXNXJ-B的發(fā)酵及其代謝產(chǎn)物的粗提 從保存在V Y/4斜面上的菌株中挑取菌株一環(huán),轉(zhuǎn)接到已滅菌的含有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中,30℃、150 r/min培養(yǎng)3 d。取種子液5 mL加入至含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中,同樣條件下培養(yǎng)7 d。取出樹脂,用水洗滌至澄清,再用10%甲醇洗滌3次,過濾,瀝干,放入干凈的三角燒瓶中,加入與發(fā)酵液等體積的甲醇,解析24 h,45℃真空濃縮,濃縮液置于4℃下24 h,取出后于10 000 r/min離心10 min,留上清液去沉淀,作為穩(wěn)定性和定性初步分析用樣品。

1.2.2 抑制率的測(cè)定 抑制率的測(cè)定采用MTT法[11]。樣品于45℃烘干后用少量二甲亞砜(DMSO)溶解,然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中,加入的DMSO含量不能超過0.5%。用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定其OD值,計(jì)算樣品對(duì)細(xì)胞的抑制率±SD和對(duì)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50值。

細(xì)胞的抑制率(%)=(正常細(xì)胞孔OD值-加藥細(xì)胞孔OD值)/正常細(xì)胞孔OD值×100%

1.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抗腫瘤活性物質(zhì)合成的影響發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)定為3、4、5、6、7、8、9 d,發(fā)酵結(jié)束后取出樹脂,用20 mL甲醇解析,24 h后取0.4 mL于45℃烘干,測(cè)定其對(duì)Hep G2腫瘤細(xì)胞抑制率。每種培養(yǎng)條件設(shè)3個(gè)平行樣,重復(fù)3次。

1.2.4 不同的樹脂對(duì)活性物質(zhì)提取的影響

HPD100、HPD300、HPD600、HPD450、D101、XAD16、DM301、AB8和DA201共9種大孔吸附樹脂先用95%乙醇浸泡24 h,使樹脂充分溶脹,用去離子水洗盡乙醇。用5%HCl溶液浸泡4 h,而后用去離子水洗至中性。再用2%的NaOH浸泡4 h,用去離子水洗至中性,晾干。每種樹脂稱取1 g,加入裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,發(fā)酵培養(yǎng)7 d后,用相同體積的甲醇解析,取0.4 mL 45℃烘干后加0.02 mL DMSO溶解,測(cè)不同樹脂對(duì)Hep G2的抑制率。每種樹脂設(shè)3個(gè)平行樣,重復(fù)3次。

1.2.5 活性物質(zhì)穩(wěn)定性的測(cè)定

1)熱穩(wěn)定性試驗(yàn):各取0.2 mL的甲醇浸提液于5 mL試管中,在溫度為50、60、70、80、90、100℃的水浴鍋中保溫1 h。處理后,45℃烘箱中至恒重,測(cè)其抗腫瘤細(xì)胞活性。4℃條件下保存的甲醇浸提液為對(duì)照,測(cè)其對(duì)Hep G2的抑制率,重復(fù)3次[12]。

2)酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn):取11份甲醇浸提液,每份5 mL,用濃度為1 mol/L的NaOH和1 mol/L的

HCl將樣品分別調(diào)成p H值1～11,然后在室溫下放置。24 h后將p H調(diào)至7,從每個(gè)樣品中取出0.2 mL,45℃烘干,以未經(jīng)酸堿處理的4℃保存的浸提液為對(duì)照,測(cè)其對(duì)Hep G2的抑制率,重復(fù)3次[13]。3)光照和紫外線照射穩(wěn)定性的測(cè)定:浸提液2 mL于小燒杯中,置于自然光和15 W紫外線下分別照射2,4,6,8,10,12 h,照射距離為40 cm,然后從每個(gè)樣品中取0.2 mL,45℃烘干,以4℃條件下保存的、未經(jīng)紫外線處理的浸提液為對(duì)照,測(cè)其對(duì)

Hep G2的抑制率,重復(fù)3次。

1.2.6 抗腫瘤活性物質(zhì)的初步分析 取甲醇解析物進(jìn)行FeCl3試驗(yàn)、鹽酸-鎂粉試驗(yàn)和氯仿-濃硫酸試驗(yàn)等試驗(yàn),具體方法參照文獻(xiàn)[14]。

2 結(jié) 果

2.1 StigmatellaWXNXJ-B代謝產(chǎn)物對(duì)HepG2生長(zhǎng)的影響

從圖1可以看出,菌株的代謝產(chǎn)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。劑量為14.0μg/mL,在加藥48 h后細(xì)胞的抑制率40%左右;而劑量在35.0μg/mL時(shí),對(duì)細(xì)胞的抑制率在95%左右,有很少的細(xì)胞存活。2個(gè)加藥組與加藥前相比,后者的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量要多于前者,因此活性物質(zhì)可能促使腫瘤細(xì)胞凋亡。

圖1 StigmatellaWXNXJ-B代謝產(chǎn)物對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of metabolites fromStigmatellaWXNXJB on HepG2 cell growth

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)和抗腫瘤物質(zhì)含量的影響

30℃、150 r/min對(duì)粘細(xì)菌WXNXJ-B菌株進(jìn)行培養(yǎng),在培養(yǎng)3、4、5、6、7、8、9 d后分別取樣測(cè)定樹脂的甲醇解析物對(duì)Hep G2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率和菌體的生物量的影響,結(jié)果見圖2。菌體生物量在第3天達(dá)到最大,為4.35 g/L,在第2～4天菌體代謝產(chǎn)物對(duì)Hep G2細(xì)胞抑制率增加較快,在第7天達(dá)到最高,為79.04%,因此發(fā)酵時(shí)間最好為7 d。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)活性物質(zhì)和菌體生物量的影響Fig.2 Effect of different fermentation time on bioactivity substance and biomass ofStigmatellaWXNXJ-B

2.3 樹脂的篩選

從圖3中可以看出,在9種樹脂中,HPD100、XAD16和DA201這3種樹脂的吸附效果較好,其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率分別為63.1%、59.4%和54.5%。在粘細(xì)菌WXNXJ-B菌株發(fā)酵生產(chǎn)抗腫瘤活性物質(zhì)中優(yōu)先選擇這3種樹脂。

圖3 不同樹脂對(duì)活性物質(zhì)吸附效果的影響Fig.3 Effect of different resins on bioactivity substanceadsorption

2.4 活性物質(zhì)的穩(wěn)定性

2.4.1 活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性 圖4表明,在水浴加熱條件下,浸提液的抗Hep G2活性比較穩(wěn)定,70℃以前的活性比較穩(wěn)定,和45℃時(shí)相比仍然能達(dá)到100%;高于70℃時(shí),隨著溫度的升高,抗Hep G2的活性能力逐漸下降。由此可以說明,該活性物質(zhì)具有較好熱穩(wěn)定性。

圖4 活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of antitumor bioactivity substance

2.4.2 活性物質(zhì)的自然光穩(wěn)定性 從圖5中可以看出,活性物質(zhì)在自然光下照射2、4、6、8、10、12 h后活性比率變化不大,說明該活性物質(zhì)在自然光照射一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 活性物質(zhì)的紫外光穩(wěn)定性 圖6表明,活性物質(zhì)在15 W紫外燈下照射2、4、6、8、10、12 h后活性比率變化不大,和對(duì)照一樣,都保持在95%左右。說明在一定時(shí)間內(nèi),紫外照射對(duì)活性物質(zhì)基本上沒有影響。

圖5 活性物質(zhì)的自然光穩(wěn)定性Fig.5 The stability of antitumor bioactivity substance with daylight

圖6 活性物質(zhì)的紫外穩(wěn)定性Fig.6 The stability of antitumor bioactivity substance with ultraviolet light

2.4.4 活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性 圖7表明(0處為對(duì)照樣品),活性物質(zhì)在p H 3～10時(shí)比較穩(wěn)定;p H 1～2時(shí),抑制率只有50%左右,只有對(duì)照的60%; p H 11時(shí),抑制率只有55%左右,和對(duì)照相比低20%。說明在酸堿性比較強(qiáng)的條件下,浸提液里的活性物質(zhì)不穩(wěn)定,可能會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化,從而導(dǎo)致對(duì)Hep G2細(xì)胞抗性的降低,在以后的處理樣品和分離純化過程中盡量不與酸堿性強(qiáng)的物質(zhì)混合。

圖7 活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性Fig.7 Acid and alkal stability of antitumor bioactivity substance

2.5 樹脂提取物的初步定性分析

如表1所示,FeCl3試驗(yàn)、茚三酮試驗(yàn)、I-KI試驗(yàn)、溴酚蘭試液、醋酐濃硫酸試驗(yàn)、堿液試驗(yàn)等試驗(yàn)均無(wú)明顯變化,顯示均無(wú)皂甙類、有機(jī)酸類、酚類、蒽醌、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、生物堿、鞣質(zhì)等化合物。α-萘酚試驗(yàn)出現(xiàn)磚紅色環(huán)反應(yīng),顯示可能含有糖、多糖或甙類物質(zhì);鎂粉-HCl試驗(yàn)呈紅色,可能含有黃酮類物質(zhì);氯仿-濃硫酸試驗(yàn)氯仿層呈紅色,可能含有甾體類物質(zhì);開閉環(huán)試驗(yàn)加1%NaOH澄清,加2%HCl混濁,可能含有香豆素、內(nèi)酯類、黃酮類、糖甙類和甾體類物質(zhì)。

表1 StigmatellaWXNXJ-B代謝產(chǎn)物的顯色反應(yīng)Tab.1 Color reaction of the metabolite fromStigmatellaWXNXJ-B

3 結(jié) 語(yǔ)

StigmatellaWXNXJ-B所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出很好的抗腫瘤細(xì)胞Hep G2的能力,加藥后的細(xì)胞和加藥前的細(xì)胞相比,在數(shù)量上后者多于前者,說明細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞主要起殺傷作用。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),對(duì)小鼠黑色素瘤B16和人乳腺癌MDA-MB231腫瘤細(xì)胞具有較高的生長(zhǎng)抑制效果,而對(duì)正常小鼠的腎臟細(xì)胞基本不起作用,因此活性物質(zhì)是通過促使腫瘤細(xì)胞凋亡而使細(xì)胞死亡的。對(duì)其代謝產(chǎn)物的初步分析,含有內(nèi)酯類、苷類和甾體類物質(zhì),起作用的可能是其中的一種或者多種。

不同粘細(xì)菌其產(chǎn)生的活性物質(zhì)類型不同,其發(fā)酵和提取條件也不盡相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,StigmatellaWXNXJ-B產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì)的最佳培養(yǎng)時(shí)間為7 d,菌株在培養(yǎng)至3 d時(shí)其菌體生長(zhǎng)量最大,然后菌體停止生長(zhǎng),活性物質(zhì)開始積累,至7 d時(shí)達(dá)到最大量。在粗提中,HPD100、XAD16和DA201這3種樹脂的吸附效果較好。在本研究中,StigmatellaWXNXJ-B所產(chǎn)生的活性物質(zhì)在不高于70℃的條件下保持較高的活性,對(duì)自然光和紫外光不敏感,在p H 3～10時(shí)較穩(wěn)定。

這些研究為此菌株產(chǎn)抗腫瘤物質(zhì)的后續(xù)研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供了工藝依據(jù),具有重要的實(shí)際意義。由于粘細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)種類多且作用機(jī)制多樣,使它成為目前研究的熱點(diǎn)。但由于其自身特性的限制,分離純化及難培養(yǎng)的特點(diǎn)成為制約研究開發(fā)粘細(xì)菌的一個(gè)瓶頸,隨著對(duì)其代謝產(chǎn)物研究的逐步重視,粘細(xì)菌的研究在中國(guó)將有更大的發(fā)展。

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(責(zé)任編輯:李春麗)

Production of Antitumor Substances fromS.tigmatellaWXNXJ-B

WANG Da-hong, TAO Wen-yi＊
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

In this study,the antitumor effect of the metabolites fromStigmatellaWXNXJ-B was analyzing by Hep G2 cell using MTT method.Furthermore,the stability of the metabolites under different physical and chemical environment was examined and the qualitative characteristics of the metabolites were analysis.The results showed that the antitumor bioactive metabolites efficient inhibited the growth ofHep G2 cell.The optimum fermentation time of antitumor substance was 7 days.HPD100,XAD16 and DA201 resin were efficient to adsorb the bioactive metabolites.The antitumor bioactivity on Hep G2 cell line did not obviously change when the temperature was lower 70℃,p H was in the range from 3 to 10 and the metabolites were treated with daylight and ultraviolet light during 12 h.It was detected that lactones,glycosides and steroids components existed in the metabolites.

StigmatellaWXNXJ-B,antitumorbioactivemetabolites,stability,qualitative analysis

Q 819

:A

1673-1689(2010)01-0104-06

2009-05-06

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA021501)。

王大紅(1980-),男,河南固始人,發(fā)酵工程專業(yè)博士研究生。

＊通訊作者:陶文沂(1946-),男,江蘇無(wú)錫人,工學(xué)博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事發(fā)酵工程與生物制藥方面的研究。Email:wytao1946@163.com