聚維酮碘栓微生物限度檢查法驗證試驗

丘展鋒 黃國玉

建立聚維酮碘栓微生物限度檢查方法，并對該法的有效性進行評價。通過試驗確定了聚維酮碘栓的微生物限度檢查方法。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及試劑 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基;改良馬丁液體培養(yǎng)基;改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基;玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;無菌硫代硫酸鈉滴定液(0.1 mol/L);0.9%無菌氯化鈉溶液;pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液;膽鹽乳糖培養(yǎng)基;甘露醇高鹽瓊脂平板，十六烷三甲基溴化銨平板。陽性對照菌:大腸埃希［cMcc(B)44102］，金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］，枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］，銅綠假單孢菌［ECMCC(B)10104］，白色念珠菌［CMCC(F)98001］，黑曲霉菌［CMCC(F)98003］(菌種均由中國藥品生物制品檢定所提供)。

1.2 供試品聚維酮碘栓，廣東慶發(fā)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

2 陽性對照菌液的制備

取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃ 下培養(yǎng)18 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1 ml中含菌數(shù)約為50～100 cfu的陽性對照菌液備用;另取白色念珠菌的改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于改良馬丁液體培養(yǎng)基中，25℃ 下培養(yǎng)24 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1 ml中含菌數(shù)約為50～100 cfu的陽性對照菌備用;取黑曲霉斜面培養(yǎng)物，至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7 d，加3～5 ml0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，用0.9%氯化鈉溶液稀釋至每1 ml含菌數(shù)約為50～100 cfu的陽性對照菌備用。

3 預試驗

常規(guī)檢查法檢查供試品對各種菌株的抑菌程度取供試品10 g用45℃ pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，振搖溶解，作為1:10的供試液，取該供試液各lml，分別注入平皿，再分別加入“2.”項下對照菌液大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各1 ml，傾注相應培養(yǎng)基培養(yǎng)后，計數(shù)。結(jié)果見表1。

檢驗結(jié)果表明聚維酮碘栓對細菌、霉菌及酵母菌都具有較強的抑菌作用，故不能用常規(guī)的微生物限度檢查法檢查聚維酮碘栓的微生物限度。用薄膜過濾法需要用大量的沖洗液，最后我們選用了中和法進行驗證。

4 驗證

4.1 方法與結(jié)果

4.1.1 供試液制備方法 取供試品10 g，加至45℃含30 ml無菌水的三角燒杯中，充分振搖，使供試品溶解。然后加10 ml無菌硫代硫酸鈉滴定液(0.1 mol/L)，再用45℃的pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，振搖5～10 min，作為1:10的供試液。

表1 常規(guī)檢查法檢查供試品對各種菌株的抑菌程度試驗結(jié)果(株，%)

4.1.2 檢查方法驗證

4.1.2.1 細菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)測定方法的驗證(陽性菌回收率試驗)菌數(shù)測定所用培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間:加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及相應空白組傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30℃ ～35℃培養(yǎng)48 h;加入白色念珠菌、黑曲霉及相應空白組傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基20℃ ～25℃培養(yǎng)72 h。

①陽性對照菌液組:取“2”項下的對照菌液大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各1 ml，分別注入平皿，傾注相應培養(yǎng)基培養(yǎng)后，計數(shù)。結(jié)果見表2;②稀釋液對照組:取45℃含30 ml無菌水的三角燒杯，然后加入10 ml無菌硫代硫酸鈉滴定液(0.1 mol/L)，再用45℃的pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，振搖5～10 min，作為1:10的供試液。取該供試液各lml分別注入平皿再分別加入“2”項下的對照菌液大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各lml，傾注相應培養(yǎng)基培養(yǎng)后，計數(shù)。結(jié)果見表2;③供試品對照組:取“4.1.1”制備的供試液各lml，分別注入平皿，傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)后，計數(shù)。結(jié)果(見表2);④供試品試驗組:取“4.1.1”制備的供試液各lml，分別注入平皿，再分別加入“2”項下對照菌液大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各1 ml，傾注相應培養(yǎng)基培養(yǎng)后，計數(shù)。結(jié)果見表2。

以上各組每次試驗用2個平皿，試驗重復3次。

表2 各菌種試驗結(jié)果

4.1.2.2 控制菌檢查方法的驗證

①金黃色葡萄球菌檢查方法的驗證:控制菌測定所用培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間:加金黃色葡萄球菌至100 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置35℃培養(yǎng)24 h后，劃線于甘露醇高鹽瓊脂平板，置35℃培養(yǎng)24 h。

陽性對照組 取“2.”項下對照菌液金黃色葡萄球菌1 ml，加入含有100 ml營養(yǎng)肉湯的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，劃線培養(yǎng)，觀察。結(jié)果見表3。

陽性試驗組取“4.1.1.”制備的供試液10 ml，接種于含有100 ml營養(yǎng)肉湯的培養(yǎng)基中，再加入“2.”項下對照菌液金黃色葡萄球菌培養(yǎng)，劃線培養(yǎng)，觀察。結(jié)果見表3。

供試品對照組 取“4.1.1.”制備的供試液10 ml，接種于含有100 ml營養(yǎng)肉湯的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察。結(jié)果見表3。

②銅綠假單孢菌檢查方法的驗證:控制菌測定所用培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間:加銅綠假單胞菌至100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置35℃培養(yǎng)24 h后，劃線于十六烷三甲基溴化銨平板，置35℃培養(yǎng)24 h。

陽性對照組取“2.”項下對照菌液銅綠假單胞菌1 ml，加入含有100 ml膽鹽乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，劃線培養(yǎng)，結(jié)果見表3。

陽性試驗組取“4.1.1.”制備的供試液10 ml，接種于含有100 ml膽鹽乳糖的培養(yǎng)基中，再加入“2.”項下對照菌液銅綠假單胞菌培養(yǎng)，劃線培養(yǎng)，觀察。結(jié)果見表3。

供試品對照組取“4.1.1.”制備的供試液10 ml，接種于含有100 ml膽鹽乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察。結(jié)果見表3。

以上各組試驗每次平行測定2次，試驗重復3次。

表3 控制菌檢查方法驗證結(jié)果

5 討論

《中國藥典》(2005年版)規(guī)定微生物限度檢查法結(jié)果判定在3次獨立的平行試驗中，稀釋液對照組及試驗組細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法驗證的回收率應不低于70%，低于70%則表明該樣品有抑菌作用?？刂凭鷻z查方法驗證時，陽性對照菌應檢出，陰性對照菌不得檢出。如驗證結(jié)果達不到規(guī)定，應采用其他方法消除供試品的抑菌活性，并對方法重新進行驗證。

從以上結(jié)果可以看出，該試驗方法達到《中國藥典》(2005年版)的規(guī)定要求。