李雪英 韓惠云 李志平

現(xiàn)代輸血技術(shù)的核心理念是安全和有效輸血。近年來，由于血液傳染性指標(biāo)的檢測(cè)技術(shù)不斷進(jìn)步，經(jīng)輸血傳染病毒的危險(xiǎn)性已大幅度降低。但是，由于人類血型抗原系統(tǒng)的復(fù)雜性，由輸血引起的輸血免疫反應(yīng)時(shí)有發(fā)生［1］。保證患者輸注免疫學(xué)“相容”的血液，預(yù)防輸血不良反應(yīng)，已成為廣大輸血工作者的重要研究課題。我國(guó)專家多年前就已經(jīng)提出，輸血前應(yīng)對(duì)受血者和供血者的紅細(xì)胞不規(guī)則抗體進(jìn)行篩選［2］，以提高臨床輸血的安全性和有效性。但常規(guī)的試管法由于費(fèi)時(shí)繁瑣，不可能對(duì)大量獻(xiàn)血者的不規(guī)則抗體進(jìn)行批量篩檢。為此，筆者將96孔U型微板看作是96個(gè)“短”試管的聯(lián)合體，將間接抗人球蛋白試驗(yàn)改良后在微板中進(jìn)行，使獻(xiàn)血者不規(guī)則抗體的批量篩檢簡(jiǎn)單易行，和試管法對(duì)比效果良好，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 試劑 抗人球蛋白試劑(IgG)、抗-D(IgG)、篩選細(xì)胞、譜細(xì)胞由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供;抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、抗-Fya、抗-JKa 由加拿大 Dominion Biologicals Limited公司提供;所有試劑均在有效期內(nèi)使用。指示細(xì)胞由筆者在使用當(dāng)天配制。

1.2 儀器設(shè)備 AT全自動(dòng)樣本處理系統(tǒng)(瑞士HAMILTON公司);Labofuge400平板離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司);HH.W21.600型電熱恒溫水浴箱(北京光明醫(yī)療儀器廠);HTⅢ掃描酶標(biāo)儀(奧地利ANTHOS公司);KA-2200血球洗滌離心機(jī)(日本KUBOTA公司);TG-328A光學(xué)分析天平(湘儀天平儀器廠);96孔硬質(zhì)U形微型板(丹麥Nunc公司)。

1.3 檢測(cè)樣品

1.3.1 19份已知不規(guī)則抗體為陽性的獻(xiàn)血者和受血者血清(由日常工作中用試管法篩查并已用譜細(xì)胞確定了抗體特異性)，用該法重新進(jìn)行抗體篩查。

1.3.2 7 份標(biāo)準(zhǔn)抗血清:將抗-D(IgG)、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、抗-Fya、抗-JKa分別倍比稀釋后，和試管法平行測(cè)定其效價(jià)。

1.3.3 分批次隨機(jī)抽取本站無償獻(xiàn)血者標(biāo)本2160份(2009年1月～2009年6月，每周三次，每次30份)，和試管法平行篩查其不規(guī)則抗體，陽性結(jié)果用譜細(xì)胞確定抗體的特異性。

1.4 醛化、包被篩選紅細(xì)胞

1.4.1 將篩選紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次，再用pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌1次，用含3.4%葡萄糖的磷酸鹽緩沖液配制成1%的紅細(xì)胞懸液。

1.4.2 用0.05%的戊二醛處理微板，每孔加入100 μl，靜置20 min，棄去，生理鹽水洗滌1次。

1.4.3 將1%篩選紅細(xì)胞加入微孔板中，每孔50 μl，300 g離心2 min，使紅細(xì)胞平鋪孔底，靜置20 min。

1.4.4 用生理鹽水洗滌3遍，每次均輕輕拍干備用。

1.5 抗人球蛋白試劑的稀釋 用微板法對(duì)比試驗(yàn)，確定抗人球蛋白試劑的最佳稀釋度為1∶3。

1.6 指示細(xì)胞的配制:將3人份O型紅細(xì)胞混合，用生理鹽水洗滌3次，取適量壓積紅細(xì)胞等量加入IgG抗-D血清，37℃孵育30 min，離心去上清，用生理鹽水洗滌5次，再用pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌1次，用含3.4%葡萄糖的磷酸鹽緩沖液配制成1%的紅細(xì)胞懸液備用。

1.7 檢測(cè)

1.7.1 用AT全自動(dòng)樣本處理系統(tǒng)將檢測(cè)樣品加入醛化、包被好篩選紅細(xì)胞的微板中，每孔100 μl，同時(shí)做陽性、陰性對(duì)照各2孔，陽性對(duì)照加入與篩選細(xì)胞含有對(duì)應(yīng)抗體的血清100 μl，陰性對(duì)照加入 AB 型血漿 100 μl，37℃孵育 30 min。

1.7.2 棄去孔內(nèi)液體，用生理鹽水洗滌5遍，每次均輕輕拍干。

1.7.3 加入稀釋好的抗人球蛋白試劑，每孔50 μl。

1.7.4 加入稀釋好的指示細(xì)胞，每孔50 μl。

1.7.5 1200 g離心2 min，孔內(nèi)紅細(xì)胞呈扣狀沉淀為陰性，平鋪于孔底為陽性。

1.7.6 用酶標(biāo)儀判讀結(jié)果 根據(jù)孔內(nèi)指示細(xì)胞分布情況，用酶標(biāo)儀判斷結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 19份抗體陽性標(biāo)本陽性檢出率100%，未出現(xiàn)假陰性。

2.2 7種抗血清效價(jià)比較，相差不超過1個(gè)滴度，見表1。

2.3 2160份獻(xiàn)血者標(biāo)本，試管法檢出5份，陽性檢出率0.23%，微板法檢出7份，陽性檢出率0.32%，經(jīng)譜細(xì)胞確認(rèn)，具有臨床意義的特異性抗體均為5份，分別為1份抗-D、2份抗-E、1份抗-M、1份抗-c，說明微板法有一定的假陽性。

表1 微板法和試管法檢測(cè)7種抗血清效價(jià)比較

3 討論

隨著輸血事業(yè)的不斷發(fā)展，聚凝胺、凝膠試驗(yàn)、酶法等新的不規(guī)則抗體檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用。但確定不完全抗體的最可靠方法仍然是抗人球蛋白法［3］。在本報(bào)告中，筆者使用的微板法原理仍是抗人球蛋白試驗(yàn)，改良的核心是將篩選紅細(xì)胞(抗原)固定在微板的底部，加入血清(抗體)孵育反應(yīng)后，洗滌時(shí)不需要離心，包被的篩選紅細(xì)胞也脫落很少，當(dāng)加入抗人球蛋白試劑和指示細(xì)胞后，結(jié)果非常容易觀察和判讀，從而克服了傳統(tǒng)試管法費(fèi)時(shí)費(fèi)力的弊端，使試驗(yàn)變得方便快捷。另外筆者還利用了醛化紅細(xì)胞具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)抗原或抗體的能力的原理［4］，用戊二醛處理微板固定紅細(xì)胞，不但使紅細(xì)胞和板底結(jié)合的更牢固均勻，同時(shí)也提高了試驗(yàn)的靈敏度，更宜于結(jié)果判讀。本法還具有以下兩方面優(yōu)點(diǎn)，一是標(biāo)本量大時(shí)，可利用全自動(dòng)設(shè)備加樣和判讀結(jié)果，使檢測(cè)批量化;二是因抗人球蛋白試劑需要稀釋而降低了成本。不足之處是存在一定的假陽性，但和假陰性比較可以進(jìn)一步保證輸血安全。由此可見，微板法抗人球蛋白試驗(yàn)具有良好的穩(wěn)定性和靈敏性，且簡(jiǎn)單、易行、高效，完全可以替代試管法對(duì)獻(xiàn)血者和受血者進(jìn)行不規(guī)則抗體篩檢。

［1］田兆嵩.臨床輸血學(xué).人民衛(wèi)生出版社，2002:246.

［2］王培華.輸血技術(shù)學(xué).人民衛(wèi)生出版社，1998:147-150.

［3］李勇，楊貴貞.人類紅細(xì)胞血型學(xué)實(shí)用理論與實(shí)驗(yàn)技術(shù).中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1999:158.

［4］邢培清，劉玉振.實(shí)用輸血檢驗(yàn).鄭州大學(xué)出版社，2001:195.