秦 雯,曲 睿,汪萌芽

(皖南醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞電生理研究室,安徽 蕪湖 241002)

時反應(yīng)量-效關(guān)系的概念及其相關(guān)數(shù)學(xué)模型[1,2],通常用于藥物作用的分析[3,4],非藥物性作用過程的時反應(yīng)量-效關(guān)系少見研究報道。我們實驗室前期曾在 Y型迷宮試驗中檢測了正確反應(yīng)潛伏期等指標(biāo),觀察到類雙曲線型時反應(yīng)量-效關(guān)系的存在[5]。Morris水迷宮(Morris water maze)是較為理想的經(jīng)典空間學(xué)習(xí)記憶能力檢測方式[6],主要包括定位航行(place navigation)實驗和空間探索(spatial probe)實驗兩個部分,前者用逃避潛伏期(escape latency)來反映學(xué)習(xí)能力,后者以通過虛擬平臺的次數(shù)反映記憶能力,顯然都是與時間相關(guān)的時反應(yīng)指標(biāo)[1],但其是否存在時反應(yīng)量-效關(guān)系尚未見分析報道。另外,學(xué)習(xí)、記憶功能是相互交叉、并存、關(guān)聯(lián)的神經(jīng)活動過程,而在重復(fù)測試過程中,既有表現(xiàn)為刺激強度的遞增規(guī)律,又有強化或消退作用的參與,這些學(xué)習(xí)記憶能力檢測指標(biāo)的時反應(yīng)量-效關(guān)系能否反映這些作用特征,也是值得研究的問題。為此,本文應(yīng)用 Morris水迷宮測試法進行大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的檢測,并對各項指標(biāo)[7～9]進行觀察和分析,以尋找具有時反應(yīng)量-效關(guān)系的有效時反應(yīng)指標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 動物 雄性 SD大鼠 14只,動物均由南京青龍山動物中心提供。實驗動物到達(dá)實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后的體重為(257±16)g。

1.2 儀器 Morris水迷宮水池由本實驗室參照文獻[9]自制,即一直徑 120 cm,高 50 cm的不銹鋼圓形水池,分 4個象限,配有 2個直徑 10 cm、高 30 cm的平臺,一個為不銹鋼可視平臺,另一個為亞克力材料制成的透明不可視平臺。攝像設(shè)備為 Smart視頻追蹤系統(tǒng)(San Diego Instuments,USA)中的紅外攝像機(懸掛于水迷宮水池的正上方),大鼠行為Morris實驗系統(tǒng)由中國科學(xué)院心理健康重點實驗室隋南實驗室饋贈。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗條件 水迷宮實驗在安靜、視覺線索充足的房間進行,房間里的一切物品位置保持固定不變(實驗時,實驗者的位置也固定不變),以作視覺參照系。間接照明,避免光線直射水面。水溫控制在 20～25℃,并在實驗過程中保持水溫恒定。實驗前先進行尋找平臺訓(xùn)練,正式實驗包括連續(xù) 7 d的定位航行實驗和隨后的 1次空間探索實驗兩個部分。實驗于每日上午 9∶00開始進行。

1.3.2 尋找平臺訓(xùn)練方法 大鼠在進行正式測試前,先進行游泳以及尋找可視平臺的訓(xùn)練,目的是篩除游泳能力缺陷或有視力障礙的大鼠,并使大鼠知道水迷宮池內(nèi)有一平臺,可以作為逃生的目的地。訓(xùn)練時,將不銹鋼可視平臺置于迷宮水池的中心,臺面高出水面 1 cm,每只大鼠先置于平臺上適應(yīng) 20 s,隨后訓(xùn)練 3次,隨機從不同象限的入水點投入水中,學(xué)習(xí)尋找平臺 60 s,若超過 60 s仍未找到平臺,由實驗者引導(dǎo)至平臺上停留15 s,然后取出擦干放回飼養(yǎng)籠。訓(xùn)練結(jié)束后,篩除有缺陷的大鼠。

1.3.3 定位航行實驗 將透明平臺置于 4個象限中任一象限 1/2弧度,池壁到池中心距離 1/2的位置,水面高于臺面1 cm。每日測試一次,含分別從4個象限(順序隨機)面向池壁入水的 4個測試,每個測試間隔 30 s。軟件的最長檢測時間設(shè)為 60 s,駐臺時間 5 s(作為找到平臺的標(biāo)準(zhǔn))。若大鼠能找到并登上平臺,在平臺上停留 5 s后停止記錄,將軟件記錄的大鼠在水中游泳的時間記為逃避潛伏期;若大鼠 60 s內(nèi)未找到平臺,則在軟件停止計時后由實驗者引導(dǎo)其登上平臺并停留 15 s,此時的逃避潛伏期計為 60 s。Morris水迷宮實驗軟件除記錄大鼠游泳的運動軌跡圖外,還實時記錄運動時間、平臺駐留時間、運動距離、入水角度、各象限的活動時間等,并分析記錄游泳速度、分析策略等指標(biāo)。由此將 4個象限入水的 4個檢測求出平均結(jié)果,記為當(dāng)天的檢測結(jié)果。

1.3.4 空間探索實驗 第 7天定位航行實驗結(jié)束1 h后,將平臺撤離,大鼠從原平臺所在象限的對側(cè)象限入水,測試空間探索實驗一次。大鼠行為 Morris實驗系統(tǒng)軟件除記錄大鼠游泳的運動軌跡圖外,還分析記錄大鼠在 60 s內(nèi)穿過原平臺所在位置的次數(shù)。同時觀察首次通過虛擬平臺時間、游泳速度、靶象限活動時間百分比等指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計分析 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,兩組均數(shù)差異的比較用 t檢驗,多組均數(shù)差異的比較用方差分析(考慮大鼠個體間差異時用雙因素方差分析),若具有顯著性意義則用 Newman-Keuls兩兩對比測驗,多組構(gòu)成比的比較用 χ2檢驗,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定位航行實驗的指標(biāo)分析

2.1.1 逃避潛伏期 分析 14只大鼠第 1～7天的數(shù)據(jù)(圖 1 Escape latency,d1～7),其雙因素方差分析結(jié)果：動物因素 F=1.5879,P=0.1067,表明大鼠間差異沒有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義;測試日因素 F=8.5541,P=3.80E-07,表明測試日間差異具有非常顯著性意義,即隨著測試(或稱學(xué)習(xí)、刺激)次數(shù)的增加,逃避潛伏期逐漸縮短,存在時反應(yīng)量-效關(guān)系(圖 1),參照文獻[1]的分型方法,理論上屬于 T型雙曲線關(guān)系(呈反變關(guān)系),但因本實驗采用了上限性數(shù)據(jù),即有一固定的最長時間 60 s,應(yīng)歸于 P型雙曲線關(guān)系。測試日因素的日間 Newman-Keuls兩兩對比測驗顯示,僅第 1天的逃避潛伏期與第 2～7天的差異有非常顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001),提示重復(fù)測試(學(xué)習(xí))可提高大鼠的空間學(xué)習(xí)能力,并在第 3天即可接近最好成績。

2.1.2 靶象限活動時間百分比 分析 14只大鼠第 1～7天的數(shù)據(jù)(圖 1 Time in target quadrant,d1～7),其雙因素方差分析結(jié)果：動物因素 F=1.4842,P=0.1424,表明大鼠間差異無顯著性意義;測試日因素 F=10.1308,P=2.9167E-08,表明測試日間差異具有非常顯著性意義,即隨著測試次數(shù)的增加,靶象限活動時間百分比逐漸增加,存在時反應(yīng)量-效關(guān)系(圖 1),可稱為反 H型雙曲線關(guān)系(呈正變關(guān)系)[1]。測試日因素的日間 Newman-Keuls兩兩對比測驗顯示,第 1天的靶象限活動時間百分比與第 2～7天,第 2天與第 4～7天的差異有非常顯著性意義(P＜0.01),提示重復(fù)測試(學(xué)習(xí))可提高大鼠在靶象限的定位航行時間,提高空間學(xué)習(xí)能力,并在第 3天即可接近最好水平。由此可見,靶象限活動時間百分比的觀察結(jié)果,與同時檢測的逃避潛伏期結(jié)果是相互吻合的。

圖 1 大鼠Morris水迷宮實驗測試日與逃避潛伏期、靶象限活動時間百分比的時反應(yīng)量-效關(guān)系d 1～7：定位航行實驗;No plate：空間探索實驗;ˉx±s,n=14;與 No plate比較的配對 t測驗：*P＜0.05,**P＜0.01Fig 1 Timed dose-response relationship of escape latencys,percentage of swimming time in target quadrant(%)at trial days by place navigation test or spatial probe test d 1～7：place navigation test;No plate：spatial probe test;ˉx±s,n=14;Paired t test vs No plate：*P＜0.05,**P＜0.01

2.1.3 速度分析14只大鼠第 1～7天的數(shù)據(jù)(圖 2,d1～7),其雙因素方差分析結(jié)果：動物因素F=2.5801,P=0.0051,表明大鼠間差異有非常顯著性意義;測試日因素 F=0.7895,P=0.5809,表明測試日間差異沒有顯著性意義。提示動物的游泳速度在測試的時間內(nèi)保持相對穩(wěn)定。

圖 2 Morris水迷宮實驗中大鼠的游泳速度d 1 ～ d 7：定位航行實驗;No plate：空間探索實驗;ˉx±s,n=14;與No plate比較的配對t測驗：*P＜0.05Fig 2 Swimming speed of rat in Morris water maze trailsd 1 ～ d 7：place navigation test;No plate：spatial probe test;ˉx±s,n=14;Paired t test vs No plate：*P＜0.05

2.1.4 分析策略 觀察 14只大鼠第 1～7天測試的分析策略構(gòu)成比,根據(jù)軟件設(shè)定的分析策略為 4種 ,即直線式 (straight)、趨向式(tendency)、邊緣式(marginal)和隨機式(random),結(jié)果見圖 3。統(tǒng)計分析結(jié)果：χ2=46.83,P=0.0002,表明隨著測試次數(shù)增加,分析策略構(gòu)成比差異具有非常顯著性統(tǒng)計學(xué)意義,即直線式策略逐漸增多,在第 3天即已占優(yōu)勢,到第 6天達(dá) 60.71%。趨向式策略僅在第 2天占優(yōu)勢,其后隨著直線式策略使用的增多而下降。隨機式策略只在第 1天占優(yōu)勢,隨著訓(xùn)練增加而逐漸減少;而邊緣式搜索策略到第 3 d之后幾乎不再使用。

圖 3 大鼠定位航行實驗中使用的分析策略構(gòu)成比Fig 3 A percentage of strategies used in place navigation test

2.2 空間探索實驗的指標(biāo)分析 在空間探索實驗中,14只大鼠在 60 s內(nèi)的穿臺次數(shù)為(5.07±2.62)次,其中首次穿臺時間為(9.71±10.87)s(圖1 No plate),可視為首次逃避潛伏期,與第 1天的逃避潛伏期(21.95±12.20)s相比顯著縮短(配對 t測驗,P＜0.05),與第 2～7天的逃避潛伏期相比無明顯差異,提示空間探索實驗的開始,大鼠對平臺位置的空間記憶能力大致維持在經(jīng)多次定位航行訓(xùn)練后的水平。60 s測試時間內(nèi),大鼠的靶象限活動時間百分比為(48.81±9.53)%(圖 1 No plate),與第 1天和第 7天的靶象限活動時間百分比差異均有非常顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(配對 t測驗,P＜0.01),且游泳速度(圖 2 No plate)為(41.50±6.39)pixel/s,與第7天相比顯著性加快(P＜0.05)。將探索實驗的 60 s等分為兩段,進行分析比較(圖 4),前段穿臺次數(shù)明顯多于后段(配對 t測驗,P＜0.05),后段游泳速度顯著快于前段(配對 t測驗,P＜0.01)。

3 討論

本實驗觀察到 Morris水迷宮實驗的重復(fù)定位航行實驗,可提高大鼠空間學(xué)習(xí)能力,隨學(xué)習(xí)天數(shù)增加,逃避潛伏期逐漸縮短,在靶象限活動時間的百分比逐漸增加,與報道結(jié)果相吻合[7,8]。由于逃避潛伏期是時反應(yīng)指標(biāo)[1,2],而重復(fù)測試的過程,也就是重復(fù)刺激或?qū)W習(xí)的過程,呈現(xiàn)為刺激強度的累積倍增,可以看作是刺激量的增加,類似于藥效學(xué)中的藥物劑量,其與逃避潛伏期的關(guān)系,也就類似于藥物的時反應(yīng)量效關(guān)系,經(jīng)方差分析顯示測試日間差異具有顯著性意義,表明了時反應(yīng)量-效關(guān)系的存在[2]。至于逃避潛伏期的時反應(yīng)量-效關(guān)系類型,由于時反應(yīng)指標(biāo)的特殊性,應(yīng)當(dāng)有不確定結(jié)果出現(xiàn),也就是在測試的觀察時間內(nèi)動物不能找到平臺,潛伏期趨向于無窮大;而當(dāng)測試次數(shù)增大時,也不是無限縮短,總有一趨向的最短潛伏期存在,理論上屬于 T型雙曲線關(guān)系(呈反變關(guān)系)[1,2]。不過,由于本實驗采用了上限性數(shù)據(jù),即有一固定的最長時間 60 s,應(yīng)歸于 P型雙曲線關(guān)系(可以看作T型的特例)[1,2]。對于靶象限活動時間的百分比,看起來是一種構(gòu)成比數(shù)據(jù),但其具有活動時間性質(zhì),也可看作為類似的時反應(yīng)指標(biāo),其與刺激量的關(guān)系為正變關(guān)系,但其規(guī)律與報道的 H型雙曲線關(guān)系[1,2]又有所不同,可稱為反 H型雙曲線關(guān)系,其具體定量規(guī)律有待于進一步研究。

圖 4 空間探索實驗前后兩時段大鼠穿臺次數(shù)和游泳速度的比較

實驗中發(fā)現(xiàn),空間探索實驗中的首次登臺時間其實等同于定位航行實驗中的逃避潛伏期,因此可與之前的逃避潛伏期一起比較,與第 6、7天的逃避潛伏期相近,且與第 1天的潛伏期差異有顯著性意義,提示在進行空間探索實驗之初,大鼠的空間記憶水平維持在定位航行訓(xùn)練后的水平。然而,觀察空間探索實驗的靶象限活動時間百分比,卻得出與逃避潛伏期不一致的結(jié)果,即與定位航行實驗中第1天相比有顯著性差異(高于第 1天的靶象限活動時間百分比),說明空間探索實驗有空間記憶的體現(xiàn),但同時又顯著低于第 7天的靶象限活動時間百分比,說明其探索實驗并未能反映定位航行實驗學(xué)習(xí)的結(jié)果,鑒于本實驗中探索實驗與定位航行實驗間隔僅 1 h,是否由遺忘因素所致尚不能確定。為此,我們進一步將空間探索實驗分為前后兩段時間(各 30 s)分別分析穿臺次數(shù)和游泳速度,結(jié)果表明前段的穿臺次數(shù)顯著高于后段,但游泳速度顯著低于后段。結(jié)合上述空間探索實驗的游泳速度明顯高于第 7天的結(jié)果,可以看出在空間探索實驗的初期,大鼠顯然是與前期定位航行實驗的學(xué)習(xí)相關(guān)的記憶狀態(tài)進行平臺搜尋的,是記憶的體現(xiàn),而在后期則是不同的狀態(tài)?？赡艿慕忉屖?撤去平臺后大鼠對原平臺的空間記憶在空間探索實驗的初期得到表達(dá),但隨著不斷尋找的失敗(平臺已撤),進而呈現(xiàn)記憶的消退,并開始嘗試重新尋找求生平臺,這不僅是靶象限活動時間百分比相比于第 7天定位航行實驗時降低的原因,也為上述后一時間段的游泳速度提高所證明。由此可見,空間探索實驗作為大鼠空間記憶的檢測手段,其本身對記憶能力存在著干擾或消退作用,與報道的重復(fù) Morris水迷宮訓(xùn)練并不改變空間探索實驗的穿臺次數(shù)和靶象限活動時間百分比的結(jié)果相吻合[10]。因此,在 Morris水迷宮實驗中如何進一步合理地設(shè)計空間探索實驗的次數(shù)、時間,如何進一步有效觀察和分析其動態(tài)過程,甚至同時進行記憶與記憶消退過程的分析,都值得進一步的研究。

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