Ti-SBA-15介孔材料用于磷酸化肽的高效富集

張 宇, 秦洪強(qiáng), 吳仁安, 鄒漢法

(中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

Ti-SBA-15介孔材料用于磷酸化肽的高效富集

張 宇, 秦洪強(qiáng), 吳仁安, 鄒漢法＊

(中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD I-TOF MS)檢測(cè)技術(shù),考察了Ti-SBA-15介孔材料對(duì)β-酪蛋白酶解產(chǎn)物中磷酸化肽的選擇性富集性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,含Ti和Si物質(zhì)的量比為0.08的Ti-SBA-15介孔材料可選擇性地對(duì)β-酪蛋白酶解產(chǎn)物中的磷酸化肽進(jìn)行選擇性富集;對(duì)于β-酪蛋白和牛血清白蛋白物質(zhì)的量比為1∶100的蛋白質(zhì)酶解混合液,Ti-SBA-15仍能實(shí)現(xiàn)對(duì)其磷酸化肽的有效富集。上述結(jié)果表明,作為一種多孔、高比表面積的磷酸化多肽的選擇性吸附材料,Ti-SBA-15有望在磷酸化蛋白質(zhì)組的分析中得到廣泛的應(yīng)用。

Ti-SBA-15介孔材料;磷酸化肽;選擇性富集;基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜

Abstract:A titanium-incorporated SBA-15m esoporous m aterial(Ti-SBA-15)was synthesized viatheco-condensation of tetraethy lorthosilicate(TEOS)and tetrabutyl titanateusing surfactant P123as the template.Due to the existence of Ti in the fram ew ork of SBA-15,the synthesized Ti-SBA-15was applied as the selective adsorbent of phosphopep tides from the comp lex tryp tic digest of β-casein.The matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALD I-TO F MS)analysis show ed that the phosphopep tides ofβ-casein digest could be selectively enriched by the Ti-SBA-15with Ti/Simolar ratio of0.08,even under the interference of bovine serum album in(BSA)with the molar ratio of β-casein to BSA up to 1∶100.It can be concluded that the Ti-SBA-15show ed the specific adsorption toward the phosphorylated peptides,which providesgreat potential in the specificca pture of phosphopep tides.

Key words:titanium-incorporated SBA-15m esoporous material(Ti-SBA-15);phosphopeptides;selective enrichment;matrix assistedlaser desorption/ionizationtime of flight mass spectrometry(MALD I-TO F MS)

蛋白質(zhì)的磷酸化過程是指蛋白質(zhì)在激酶的作用下將三磷酸腺苷(ATP)或三磷酸鳥苷(GTP)上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)上的過程,是生物體內(nèi)一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式[1-5],也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。目前,蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)手段是基于蛋白質(zhì)酶解技術(shù)的多肽離子化質(zhì)譜檢測(cè)方法。然而,由于非磷酸化多肽對(duì)磷酸化多肽質(zhì)譜離子化的抑制作用以及磷酸化蛋白質(zhì)的含量相對(duì)較低,使得對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的檢測(cè)較為困難[6]。因此,發(fā)展基于新型吸附材料的磷酸化肽的選擇性富集方法,避免蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中大量非磷酸化肽對(duì)磷酸化肽鑒定的干擾,對(duì)于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；姿峄鞍踪|(zhì)組的分析具有重要意義。

利用金屬氧化物(TiO2和ZrO2)或固定化金屬親和色譜( IMAC)材料對(duì)磷酸化肽進(jìn)行選擇性富集的研究已見報(bào)道[7-11],然而,這些材料有限的比表面積在一定程度上限制了其在磷酸化多肽富集中的應(yīng)用。介孔材料由于具有巨大的比表面積和2～50 nm的中孔結(jié)構(gòu),已被廣泛地用作催化劑和吸附載體。前期研究也表明,利用介孔材料(MCM-41)的高比表面積,在其介孔表面引入Ti4+或Zr4+等金屬離子可實(shí)現(xiàn)磷酸化肽的有效富集和選擇性富集[12]。由于介孔材料在合成過程中可直接加入含Ti或Zr的無機(jī)單體,因而可一步合成出Ti或Zr均勻分布在硅骨架中的介孔材料。目前,此類金屬介孔材料對(duì)磷酸化肽的選擇性富集研究尚未見報(bào)道。本文系統(tǒng)地考察了內(nèi)含Ti金屬的介孔材料Ti-SBA-15對(duì)磷酸化肽的選擇性富集作用。經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD I-TO F MS)檢測(cè)證明,Ti-SBA-15不僅合成簡(jiǎn)單,而且具有很好的對(duì)磷酸化肽的選擇性分離富集性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器:Autoflex MALD I-TO F MS購自德國B ruker D altonics公司。

試劑:聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(P123,EO20PO70EO20)購自德國BASF公司;醋酸(HAc)、醋酸鈉(N aAc)、硅酸鈉和四乙氧基硅烷(TEOS)購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;鈦酸正丁酯(Ti(O-n-Bu)4)購自A lfa-Aesar公司;乙酰丙酮購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;牛β-酪蛋白(β-casein)、牛胰蛋白酶(trypsin)、牛血清白蛋白(BSA)和2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB)均購自美國Sigm a-A ldrich公司;尿素、碳酸氫銨、二硫蘇糖醇(D TT)和碘代乙酰胺(IAA)購自美國B io-Rad公司;乙腈(ACN)和三氟乙酸(TFA)購自德國M erck公司。實(shí)驗(yàn)用水由美國M illipore公司M illi-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Ti-SBA-15的合成[13]

在10mL的小瓶中加入8.53g(3mmol)Ti(O-n-B u)4和3.06g(3mmol)乙酰丙酮,在室溫條件下攪拌成均一的黃色溶液,即得鈦前驅(qū)體Ti(O-n-B u)3(acac)。稱取1.00g P123表面活性劑和1.69g乙醇于28mL HAc-N aAc緩沖溶液(0.52 mol/L HAc,0.27mol/L N aAc,pH4.4)中,在室溫條件下攪拌至溶液澄清。然后在劇烈攪拌下,將2mL硅酸鈉溶液(200m g/L SiO2(Si的物質(zhì)的量為8.50mmol),60m g/L N a2O)加至上述表面活性劑溶液中。將表面活性劑溶液在室溫條件下繼續(xù)攪拌10m in后,加入含有8.50mmol TEOS和一定量Ti(O-n-B u)3(acac)的乙醇溶液1.69g。立即將由此得到的溶液移入40℃油浴中,繼續(xù)攪拌24h。然后將得到的固液相混合物裝入高壓釜中,放入100℃烘箱中靜置晶化24h。待冷卻至室溫后過濾,將所得固體在100℃烘箱中干燥3h,然后在550℃的靜態(tài)空氣中灼燒10h脫除P123模板劑。最后得到的樣品即為Ti-SBA-15(n),其中n為Ti-SBA-15中鈦(前驅(qū)體中的鈦)和硅的物質(zhì)的量比。

1.2.2 Ti-SBA-15孵育液的配制

稱取10m g合成的Ti-SBA-15,并加入1mL含50%(體積分?jǐn)?shù),以下不做注明的均同此)ACN和6%TFA的混合溶液。振蕩10m in后,在10 500 r/m in(13 500g)的速率下離心10m in,移除上清液。再加入1mL含50%ACN和6%TFA的混合溶液配成10m g/L孵育液,振蕩混勻后備用。

1.2.3 蛋白質(zhì)酶解

稱取一定量的β-酪蛋白(或BSA),溶解于含8 mol/L尿素的100mmol/L的碳酸氫銨緩沖液(pH 8.3)中;蛋白質(zhì)的最終濃度為10μmol/L。取1mL蛋白質(zhì)溶液,加入10μL1mol/L D TT后在37℃水浴中加熱2.5h。然后加入50μmol的IAA,在暗處于室溫下靜置0.5h。隨后,將該蛋白質(zhì)溶液用100 mmol/L的碳酸氫銨緩沖液稀釋4倍,按m(β-酪蛋白或BSA)∶m(胰蛋白酶)=25∶1的比例加入胰蛋白酶。在37℃下酶解16h后,加入0.5%甲酸終止反應(yīng)。分裝后,在-30℃條件下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 磷酸化肽的富集

將β-酪蛋白(或BSA)的酶解產(chǎn)物用含50%ACN和6%TFA的混合溶液稀釋至1pmol/μL后取1μL加至50μL的Ti-SBA-15溶液中。振蕩30 m in后,以10 500r/m in(13 500g)的速率離心10 m in,移去上清液。向底部沉淀物中加入150μL含50%ACN和6%TFA的500mmol/L N aC l溶液,振蕩5m in后,以10 500r/m in(13 500g)的速率離心10m in,移去上清液。向底部沉淀物中再加入150μL含50%ACN和0.1%TFA的混合液,振蕩5m in后,再以10 500r/m in(13 500g)的速率離心10m in,移去上清液。最后,將底部沉淀物用25μL 10%氨水超聲洗滌10m in,再以10 500r/m in(13 500g)的速率離心10m in后,收集上清液至離心管中,凍干后保存。

1.2.5 MALD I-TO F MS檢測(cè)

在上述離心管中加入5μL質(zhì)量濃度為10～50 m g/mL的2,5-DHB溶液(含1%磷酸)。取該溶液0.5μL沉積于384孔點(diǎn)的拋光不銹鋼MALD I靶上,形成共結(jié)晶。MALD I-TO F MS分析時(shí)采用氮?dú)饧す獠ㄩL為337nm,加速電壓范圍為±20kV,于正離子線性模式下檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同Ti/S i比的Ti-SBA-15對(duì)磷酸化肽選擇性富集的影響

Ti-SBA-15中Ti和Si的物質(zhì)的量比(以下稱Ti/Si比)是影響該介孔材料對(duì)磷酸化肽選擇性富集能力的重要參數(shù)之一。在實(shí)驗(yàn)中采用Ti/Si比分別為0,0.01和0.08的Ti-SBA-15介孔材料進(jìn)行考察。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,β-酪蛋白的胰蛋白酶解產(chǎn)物中3個(gè)常見的磷酸化肽段分別是m/z2 061(β1)、m/z 2 556(β2)和m/z3 122(β3),其中β1和β2分別有一個(gè)磷酸化位點(diǎn),β3有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)[12]。從圖1a可以看出,在未經(jīng)富集的β-酪蛋白酶解產(chǎn)物中存在大量的非磷酸化肽的峰。當(dāng)采用Ti/Si比為0的Ti-SBA-15介孔材料富集β-酪蛋白酶解產(chǎn)物時(shí),圖1b中既無磷酸化肽的峰,也無非磷酸化肽的峰。這說明在樣品處理過程中,沒有發(fā)生肽段的非特異性吸附。當(dāng)采用Ti/Si比為0.01的介孔材料進(jìn)行富集時(shí),在β-酪蛋白酶解液中只檢出β3和β2+3的峰(見圖1c)。當(dāng)Ti/Si比增加到0.08時(shí),可檢出β-酪蛋白酶解液中全部3個(gè)磷酸化肽的峰(見圖1d)。這說明Ti-SBA-15骨架中的Ti對(duì)磷酸化肽的選擇性富集起到?jīng)Q定性作用,且對(duì)多磷酸化肽的富集效果更佳。在以下實(shí)驗(yàn)中,均采用Ti/Si比為0.08的介孔材料。

圖1 β-酪蛋白酶解產(chǎn)物(a)未經(jīng)任何富集和經(jīng)Ti/S i比分別為(b)0,(c)0.01和(d)0.08的Ti-SBA-15富集后的MALD I-TO F M S譜圖(孵育液用量為50μL)Fig.1 MALD I-TO F M S spectra of β-case in digests(a)without and with enrichment by Ti-SBA-15with Ti/Simolar ratio of(b)0,(c)0.01and(d)0.08(incubation solution,50μL)

2.2 孵育液用量對(duì)磷酸化肽選擇性富集的影響

圖2 孵育液用量不同時(shí)T i-SBA-15(T i/S i比為0.08)富集β-酪蛋白酶解產(chǎn)物中磷酸化肽的MALD I-TO F M S譜圖Fig.2 MALD I-TO F M S spectra of phosphopep tides from β-case in digests enriched by Ti-SBA-15(Ti/Simolar ratio of0.08)with different volumes of the incubation solution

采用含Ti/Si比為0.08的Ti-SBA-15介孔材料的孵育液,考察了孵育液用量對(duì)β-酪蛋白的酶解產(chǎn)物中磷酸化肽富集效果的影響。從圖2可看出,將孵育液用量從25μL增加到50μL,β-酪蛋白酶解產(chǎn)物中富集到的3個(gè)磷酸化肽的峰強(qiáng)度有所增加;但是將孵育液用量繼續(xù)增加到100μL時(shí),磷酸化肽的峰強(qiáng)度沒有太大變化。這說明利用Ti-SBA-15介孔材料富集時(shí),用50μL的孵育液可以完全富集β-酪蛋白酶解產(chǎn)物中的磷酸化肽。

2.3 應(yīng)用T i-SBA-15富集檢測(cè)蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中磷酸化肽的最低檢出限

進(jìn)一步考察Ti-SBA-15介孔材料(Ti/Si比為0.08)對(duì)500,100和10fmol/μL的β-酪蛋白酶解產(chǎn)物中磷酸化肽的富集能力。如圖3所示,MALD ITO F MS可以檢測(cè)出100fmol/μLβ-酪蛋白酶解產(chǎn)物中的3個(gè)磷酸化肽;當(dāng)β-酪蛋白濃度降低至10 fmol/μL時(shí),質(zhì)譜圖上只有β3峰。因此,當(dāng)用β3峰來定義檢出限時(shí),應(yīng)用10m g/mL Ti-SBA-15(Ti/Si比為0.08)可富集檢出濃度最低為10fmol/μL的蛋白質(zhì)酶解液中的磷酸化肽。

圖3 Ti-SBA-15(Ti/S i比為0.08)富集(a)500f mol/μL、(b)100f mol/μL和(c)10fmol/μLβ-酪蛋白酶解產(chǎn)物中磷酸化肽的MALD I-TO F M S譜圖Fig.3 MALD I-TO F M S spectra of p hosphopep tides enriched from(a)500f mol/μL,(b)100 f mol/μL and(c)10f mol/μLofβ-case in digests by Ti-SBA-15(Ti/Simolar ratio of 0.08)

2.4 T i-SBA-15對(duì)磷酸化肽富集的特異性

采用Ti-SBA-15介孔材料對(duì)β-酪蛋白和BSA物質(zhì)的量比分別為1∶50和1∶100時(shí)組成的酶解液混合物中磷酸化肽的富集特異性進(jìn)行考察。從圖4a可以看出,在沒有經(jīng)介孔材料處理的樣品中,磷酸化肽幾乎完全被非磷酸化肽掩蓋;而采用Ti-SBA-15處理樣品后,磷酸化肽被高選擇性地富集而得到檢測(cè)(見圖4b,c),表明Ti-SBA-15對(duì)磷酸化肽有高選擇性富集能力。

圖4 (a)未經(jīng)和(b,c)經(jīng)T i-SBA-15(Ti/S i比為0.08)富集的β-酪蛋白和BSA酶解混合液的MALD I-TO F M S譜圖Fig.4 MALD I-TO F M S spectra of the digest mixtures ofβ-case in and BSA(a)without and(b,c)with enrichment by Ti-SBA-15(Ti/Simolar ratio of0.08)

2.5 尿素和D TT對(duì)磷酸化肽富集的干擾

在進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理中,經(jīng)常會(huì)使用尿素和D TT溶液。因此,在實(shí)驗(yàn)中考察了分別向孵育液中添加2mol/L尿素和50mmol/L D TT時(shí),Ti-SBA-15對(duì)磷酸化肽的選擇性富集能力。從圖5可以看出,即使在這兩種干擾物存在的情況下,Ti-SBA-15也能從多肽混合物中高選擇性地富集磷酸化肽。

圖5 (a)2m o l/L尿素和(b)50mmol/L D TT存在條件下采用Ti-SBA-15(Ti/S i比為0.08)富集的β-酪蛋白酶解產(chǎn)物中磷酸化肽的MALD I-TO F M S譜圖Fig.5 MALD I-TO F M S spectra of phosphopep tides fromβ-case in d igests en riched by Ti-SBA-15(Ti/Simolar ratio of0.08)in(a)2m o l/L urea and(b)50mmol/L D TT

3 結(jié)論

和傳統(tǒng)的基于螯合作用的介孔材料相比,骨架含鈦的Ti-SBA-15介孔材料不僅制備簡(jiǎn)單,可以有效地避免傳統(tǒng)固載金屬離子親和色譜材料合成過程中二次反應(yīng)嫁接金屬離子的過程,而且也表現(xiàn)出對(duì)磷酸化肽的高選擇性富集能力。因此,該材料有望在磷酸化蛋白質(zhì)組的研究中發(fā)揮重要作用。

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Applications of Ti-SBA-15 mesoporous material in high performance enrichment of p hosp hop ep tides

ZHANG Yu,Q IN Hongqiang,WU Ren’an,ZOU Hanfa＊
(Da lian Institute of Chemical Physics,Key Laboratory of Separation Science for Analytica l Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Da lian 116023,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0123-05

＊通訊聯(lián)系人:鄒漢法,研究員,博士生導(dǎo)師.Tel:(0411)84399610,E-m ail:hanfazou@dicp.ac.cn.

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.20735004).

2009-09-10

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00123