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      產(chǎn)β-葡聚糖酶突變株培養(yǎng)基的優(yōu)化

      2010-11-13 07:45:16邵金華劉凱楊錦兀
      湖南科技學院學報 2010年4期
      關(guān)鍵詞:麥粉產(chǎn)酶葡聚糖

      邵金華劉凱楊錦兀

      (湖南科技學院 生命科學與化學工程系,湖南 永州 425100)

      β-葡聚糖屬植物細胞壁中的結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖,是以右旋葡萄糖為基本單位,屬于多糖類中的同多糖類,具有線型的空間結(jié)構(gòu),存在于禾谷類(包括大麥、燕麥、黑麥和小麥等)的糊粉層和胚乳細胞壁中。谷物類β-葡聚糖獨特的分子結(jié)構(gòu),賦予了其獨特的性質(zhì),能以高分子量的形式溶于水,且形成溶液的粘度很高,給工業(yè)生產(chǎn)帶來了諸多的不便。β-葡聚糖酶屬于水解酶類,具有降解β-葡聚糖,破壞植物細胞壁結(jié)構(gòu);提高內(nèi)源性消化酶活性,減少腸道微生物,降低小腸內(nèi)容物粘度;利于動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收,同時,提高生長性能和糧食的轉(zhuǎn)化率,在食品、飼料工業(yè)等方面有廣闊應用前景。

      1.料和方法

      1.1.種

      突變株Bacillus subtilis spp.,由本實驗室在校園內(nèi)的土壤中篩選后誘變制得。

      1.2.要原料和試劑

      大麥粉,購自重慶漓泉啤酒廠,磨成粉,過80目篩。

      標準大麥β-葡聚糖,美國Sigma公司產(chǎn)品。

      其它試劑均為分析純。

      1.3.養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

      1.3.1.本培養(yǎng)基(g/l00ml):

      蛋白胨 1.0,牛肉膏0.4,瓊脂 1.8,NaCl0.4,pH 7.2; 121℃,25min滅菌。

      1.3.2.始培養(yǎng)基(g/100mL)

      大麥β-葡聚糖 0.2, KNO30.1, NaH2PO40.002, MgS040.03, CaCO30.005, FeCl30.002 , 剛果紅0.004,瓊脂1.8,pH 7.2,121℃,25 min滅菌。

      1.3.3.瓶發(fā)酵條件

      在250ml的三角瓶中裝入35ml培養(yǎng)基,1210C,滅菌 25 min,冷卻至室溫,接種(接種量為2.2x106個孢子/ml 發(fā)酵液),pH值6.5,370C, 200r/min振蕩培養(yǎng)60h。

      1.4.驗方法

      1.4.1.-葡聚糖酶酶活力測定[1]待測粗酶液用pH6.0的乙酸鈉緩沖液稀釋一倍,取經(jīng)60℃預熱的此稀釋酶液1.0ml,加入經(jīng)60℃預熱的1.0%β-葡聚糖溶液1.0ml,60℃恒溫準確反應10min,立即加入DNS試劑3ml,混勻,立即用DNS法測定還原糖含量。酶活單位定義: 在上述反應條件下1s中從大麥β-葡聚糖產(chǎn)生1nmol葡萄糖所需酶量為一個酶活力單位(u)。

      1.4.2.酵液,還原糖含量測定:DNS法[2]

      1.4.3.酵液總糖含量測定:鹽酸水解法[3]

      1.4.4.酵液pH測定:pH計法

      1.4.5.酶的培養(yǎng)基優(yōu)化

      在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上依次改變碳源和氮源的種類及濃度,再分別確定各微量元素的最佳添加量。

      2.果和討論

      2.1.同碳源對產(chǎn)酶的影響

      用六種常見碳源分別代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源進行單因素試驗,碳源添加量以總糖含量相等為依據(jù)。表2-1表明,大麥粉是最佳的碳源,可能是因為β-葡聚糖酶是一種典型誘導酶,特定的碳源對酶合成具有一定誘導效應[4]。

      表2.1碳源對產(chǎn)酶的影響

      2.2.同氮源對產(chǎn)酶的影響

      本實驗選擇了常用的幾種無機氮源和有機氮源進行氮源單因素實驗(添加量以N元素摩爾數(shù)相等為依據(jù))。結(jié)果表明,酵母粉為最好的氮源,其次為豆餅粉。

      表2.2 氮源對產(chǎn)酶的影響

      2.3.gSO4濃度對產(chǎn)酶的影響

      對細胞來說,Mg2+是金屬離子當中較為重要的一種,它是許多酶活性中心不可缺少的一部分,結(jié)果表明MgS04的最適濃度為0.02g/100ml,超過0.02g/100ml會抑制酶的活性。

      圖2.1 MgSO4濃度對β-葡聚糖酶產(chǎn)酶的影響

      2.4.H2PO4的濃度對產(chǎn)酶的影響

      在添加的營養(yǎng)鹽中,對KH2PO4的濃度高低是否影響β-葡聚糖酶的酶活進行了對比實驗,圖2-2表明,高濃度的KH2PO4對β-葡聚糖酶的酶活有抑制作用,KH2PO4濃度最佳量為0.002(g/l00ml)。

      2.5.aC03濃度對產(chǎn)酶的影響

      鈣一般不參與微生物的細胞結(jié)構(gòu)物質(zhì),但它是某些酶的激活劑,而且鈣離子能調(diào)節(jié)細胞透性,對β-葡聚糖酶也有一定的激活作用[5]。從圖2-3可以看出,CaC03的最適濃度0.05g/100ml.

      圖2.3 CaCO3濃度對產(chǎn)酶的影響

      2. 6正交試驗確定最佳碳氮比及最佳培養(yǎng)基配方

      本實驗選擇了大麥粉、玉米粉、豆粕粉,MgS04, CaC03濃度進行五因素四水平的正交試驗[6]。由表2-3可知,大麥粉濃度是影響最顯著的因素,五個因素對發(fā)酵產(chǎn)酶的顯著性依次為A>C> B>D>E,最佳條件分別為A3B3C4D3E3,即最適濃度(g/l00ml)為大麥粉3.0,玉米粉2.0, 豆粕粉4.0,MgSO40.03, CaCO30.05。按此方案進行驗證實驗,產(chǎn)β-葡聚糖酶活力達到56.53U/ml,是初始產(chǎn)酶條件的1.8倍.

      表2.3培養(yǎng)基配方正交試驗結(jié)果分析表

      3. 論

      采用單因素實驗和正交實驗對芽孢桿菌突變株Bacillus subtilis spp.搖瓶分批發(fā)酵生產(chǎn)β-葡聚糖酶的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了研究,得出其最佳培養(yǎng)基配方為(g/100ml): 大麥粉3.0,玉米粉2.0, 豆粕粉4.0,MgSO40.03, CaCO30.05; 糊精、大麥粉等多糖有利于突變株Bacillus subtilis spp.β-葡聚糖酶的產(chǎn)生,葡萄糖、蔗糖等易利用性碳源不利于菌體生物量的積累和β-葡聚糖酶的產(chǎn)生。酵母粉為突變株Bacillus subtilis spp.產(chǎn)β-葡聚糖酶的最佳氮源,其次為豆餅粉;試驗中選用的無機氮源均不利于β-葡聚糖酶的產(chǎn)生。MgS04和CaCO3濃度對β-葡聚糖酶的產(chǎn)生有較大影響,而KH2PO4濃度對β-葡聚糖酶的產(chǎn)生影響較小。突變株Bacillus subtilis spp.β-葡聚糖酶產(chǎn)生受大麥β-葡聚糖的誘導作用。

      [1]趙斌,何紹江.微生物學實驗[M].北京:科學出版社,2002.

      [2]周德慶.微生物學實驗手冊[M].上海:上??茖W技術(shù)出版社,1986.

      [3]楊汝德,現(xiàn)代工業(yè)微生物學[M].廣州:華南理工大學出版社,2001,157-158.

      [4]萬平平,丁愛云,李安娜,黃玉杰. 產(chǎn)β-葡聚糖酶鏈霉菌菌株的篩選及其酶特性研究[J].煙臺師范學院學報(自然科學版)2004,20(1),58-61.

      [5]孫玉英,王瑞明,劉慶軍.局限曲霉產(chǎn)β-葡聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].飼料工業(yè),2004, 25(1): 29-30.

      [6]孫玉英,王瑞明,劉慶軍.局限曲霉產(chǎn)β-葡聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].飼料工業(yè),2004, 25(1): 29-30.

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