黎 明，張俊環(huán)，周 政，牛 濤

(工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

載脂蛋白 AI(apoAI)是高密度脂蛋白(HDL)的最主要結(jié)構(gòu)成分，在外周組織中作為游離膽固醇的受體，促進(jìn)HDL對(duì)外周組織中膽固醇的攝取；在脂蛋白表面作為卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(Lecithin-cholesterol acyltransferase，LCAT)的輔助激活因子，參與膽固醇的酯化；在肝臟表面介導(dǎo)HDL與B族Ⅰ型清道夫受體(scavenger receptor class B type Ⅰ，SR-BI)的作用，將HDL中膽固醇酯轉(zhuǎn)移到肝臟進(jìn)行代謝，從而降低膽固醇在外周組織的沉積；另外，apoAI通過其抗炎、抗血栓形成和內(nèi)皮功能保護(hù)等多種作用抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展．動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)證明血漿中apoAI和HDL的含量與動(dòng)脈粥樣硬化心腦血管病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)性[1]，apoAI具有明顯的抗動(dòng)脈粥樣硬化的生物學(xué)效應(yīng)[2]．因此，apoAI基因已經(jīng)成為預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化癥的靶基因[3]．

載脂蛋白AI米蘭突變體(AIM)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的 apoAI的天然半胱氨酸突變體[4]．至今 AIM 攜帶者無一人被檢出動(dòng)脈粥樣硬化的臨床或病理表征，這主要是由于 AIM 具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)[5]和功能特性[6–7]，從而高度保護(hù)其攜帶者免于發(fā)生心腦血管疾病．與apoAI相比較，AIM 的構(gòu)象更穩(wěn)定，在血漿中的半衰期延長(zhǎng)；而且鏈間二硫鍵使 AIM 二硫鍵 C末端 40多個(gè)氨基酸殘基形成一個(gè)新的結(jié)構(gòu)域，呈環(huán)狀突出于HDL顆粒表面，結(jié)合脂的能力大大增強(qiáng)[8]，能更有效地排出細(xì)胞中的膽固醇，且較少的底物就可激活LCAT；同時(shí)，AIM 游離的巰基具有抗脂類氧化的作用[7]．因此 AIM 比 apoAI的抗動(dòng)脈粥樣硬化的能力更強(qiáng)[7,9]．

大量動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)證明，重組人 AIM 不僅能在短時(shí)間內(nèi)顯著“逆轉(zhuǎn)”動(dòng)脈粥樣硬化，而且臨床研究也未見明顯的毒副反應(yīng)．但是，由于AIM的臨床劑量在克級(jí)水平，臨床用量很大，因此AIM用于臨床治療不可能從血液中提取，可依賴基因工程技術(shù)將AIM基因在微生物中表達(dá)．前期工作已經(jīng)構(gòu)建了高效表達(dá)AIM的工程菌，為了進(jìn)一步提高表達(dá)量，降低發(fā)酵成本，本文對(duì) AIM 工程菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為其應(yīng)用研究和工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 菌株

含質(zhì)粒pET22b-AIM的重組E.coli BL21，本實(shí)驗(yàn)室保存．

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，氨芐青霉素 0.05，pH 7.0．

原始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10，蛋白胨 10，NaCl 10，氨芐青霉素 0.05，pH 7.0．

1.3 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：從平板上挑取重組 E.coli BL21單菌落，接種到裝有 30,mL種子培養(yǎng)基的 250,mL搖瓶中，37,℃、200,r/min 培養(yǎng) 14,h，制成種子液．

原始發(fā)酵培養(yǎng)：按 6%的接種量將種子液接種到裝有 30,mL原始發(fā)酵培養(yǎng)基的 250,mL搖瓶中，37,℃、200,r/min培養(yǎng) 2～3,h，當(dāng) A600為 0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.6,mmol/L，誘導(dǎo)4,h．

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

基于微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)利用情況及成本的比較，在文獻(xiàn)[10]的基礎(chǔ)上，運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)篩選出最適碳、氮源及最適濃度．

1.4.1 碳源的選擇

以10,g/L的蛋白胨為氮源，10,g/L的NaCl為無機(jī)離子，分別加入 10,g/L的葡萄糖、蔗糖和甘油進(jìn)行發(fā)酵，篩選出最適碳源；再以 10,g/L的蛋白胨為氮源，10,g/L的 NaCl為無機(jī)離子，加入 5、10、15,g/L的最適碳源，篩選出最適碳源的最適濃度．

1.4.2 氮源的選擇

以最適濃度的最適碳源和 10,g/L的 NaCl為培養(yǎng)基基本組分，分別加入 10,g/L的酵母粉、蛋白胨、黃豆餅粉，經(jīng)發(fā)酵篩選出最適有機(jī)氮源；再以最適濃度的最適碳源和10,g/L的NaCl為培養(yǎng)基基本組分，加入 5、10、15,g/L的最適有機(jī)氮源，篩選出最適有機(jī)氮源的最適濃度．

以最適濃度的最適碳氮源和 10,g/L的 NaCl為培養(yǎng)基基本組分，分別加入含氮量為0.56,g/L的不同無機(jī)氮源(g/L)：硫酸銨 2.64、硝酸銨 1.60和氯化銨2.12，篩選出最適無機(jī)氮源；再以最適濃度的最適碳氮源和10,g/L的NaCl為培養(yǎng)基基本組分，分別加入2、3、4,g/L的最適無機(jī)氮源，篩選出最適無機(jī)氮源的最適濃度．

1.4.3 正交實(shí)驗(yàn)

利用 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)篩選出蔗糖、酵母粉和硫酸銨的最佳配比．

1.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 裝液量的確定

以原始發(fā)酵培養(yǎng)為基礎(chǔ)，分別將種子液接種到不同體積的最適發(fā)酵培養(yǎng)基中，篩選出最適裝液量．

1.5.2 接種量的確定

以原始發(fā)酵培養(yǎng)為基礎(chǔ)，分別按不同的接種量進(jìn)行接種，篩選出最適接種量．

1.5.3 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的確定

以原始發(fā)酵培養(yǎng)為基礎(chǔ)，分別在 A600為 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4時(shí)加入 IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，篩選出最適誘導(dǎo)時(shí)機(jī)．

1.5.4 誘導(dǎo)劑量的確定

以原始發(fā)酵培養(yǎng)為基礎(chǔ)，加入 IPTG至終濃度分別為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2,mmol/L，篩選出最適誘導(dǎo)劑量．

1.5.5 誘導(dǎo)時(shí)間的確定

以原始發(fā)酵培養(yǎng)為基礎(chǔ)，分別誘導(dǎo) 3、4、5、6、7、8,h，篩選出最適誘導(dǎo)時(shí)間．

1.6 分析方法

1.6.1 生物量的測(cè)定

以未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)期發(fā)酵液在 600,nm 波長(zhǎng)下的吸光度，使其在0.10～0.65之間，經(jīng)稀釋后測(cè)得的 A600乘以稀釋倍數(shù)即為生物量的值．

1.6.2 SDS-PAGE蛋白電泳

收集發(fā)酵菌體，完全超聲破碎后離心取上清液，用 15%分離膠和 5%濃縮膠進(jìn)行 SDS-PAGE．電泳完畢后分別用考馬斯亮藍(lán)染色液和脫色液進(jìn)行染色和脫色．

1.6.3 AIM表達(dá)量的測(cè)定

以不含質(zhì)粒的 E.coli BL21為對(duì)照，采用改良的Bradford蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定 AIM 的表達(dá)量．操作方法：取 4 μL蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(牛血清白蛋白溶液)加 PBS稀釋至 100,μL(一般可用 PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品)，使終濃度為 200,μg/mL；將稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品按 0、1、4、6、8、10、15,μL 分別添加到 96 孔板中，加 PBS 補(bǔ)足至 20,μL，每孔蛋白含量分別為：0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0,μg；加適當(dāng)體積樣品到 96 孔板中，加 PBS至 20,μL；各孔加 200,μL Bradford Reagent，混勻，室溫放置 5,min；用預(yù)熱的酶標(biāo)儀測(cè)定 A595并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白濃度．

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源

由表 1可知，以葡萄糖為碳源的菌體 A600最大，以蔗糖為碳源的菌體 A600稍低，但是 AIM 的表達(dá)量最高，故選用蔗糖作為碳源．蔗糖最適濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為 10,g/L時(shí) AIM 表達(dá)量最高，達(dá)1.625,g/L．

表1 不同碳源下工程菌的生物量及AIM表達(dá)量Tab.1 Biomass and AIM expression levels of engineering bacteria for different carbon sources

以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基AIM表達(dá)量反而不及另外兩種培養(yǎng)基，可能是由于微生物在利用葡萄糖作為碳源時(shí)，葡萄糖降解速度較快，使得降解速度超過菌體吸收速度，一些葡萄糖代謝物如丙酮酸、乙酸等在細(xì)胞內(nèi)積累，從而降低了環(huán)境的 pH，抑制了菌體代謝物的產(chǎn)出．

2.1.2 氮源

有機(jī)氮源在發(fā)酵培養(yǎng)基中不僅是菌體生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)，有些還是某些產(chǎn)物合成的前體．常用的有機(jī)氮源有酵母粉、蛋白胨、花生餅粉、黃豆餅粉等．本實(shí)驗(yàn)用酵母粉、蛋白胨、黃豆餅粉作試用氮源．由表 2可知，以酵母粉為氮源的菌體A600最大，且AIM的表達(dá)量最高，因此選用酵母粉作為有機(jī)氮源．酵母粉最適濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為 10,g/L時(shí) AIM 表達(dá)量最高，達(dá)1.648,g/L．

無機(jī)氮源吸收快、易利用、成分簡(jiǎn)單．在確定了碳源和有機(jī)氮源之后，以硫酸銨、硝酸銨、氯化銨為無機(jī)氮源，考察其對(duì)菌體生長(zhǎng)及 AIM 表達(dá)量的影響．由表 3可知，以硝酸銨為氮源的菌體 A600最大，其次為硫酸銨，但以硫酸銨為氮源的AIM 表達(dá)量最高，因此選用硫酸銨作為無機(jī)氮源．硫酸銨最適濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為4,g/L時(shí)AIM表達(dá)量最高，達(dá)1.772,g/L．

表2 不同有機(jī)氮源下工程菌的生物量及AIM表達(dá)量Tab.2 Biomass and AIM expression levels of engineering bacteria for different organic nitrogen sources

表3 不同無機(jī)氮源下工程菌的生物量及AIM表達(dá)量Tab.3 Biomass and AIM expression levels of engineering bacteria for different inorganic nitrogen sources

2.1.3 正交實(shí)驗(yàn)

由表 4可知，在蔗糖、酵母粉和硫酸銨 3種培養(yǎng)基組分的不同配比中，AIM 表達(dá)量最高的組合為(g/L)：蔗糖 10，酵母粉 10，硫酸銨 6．極差分析結(jié)果表明硫酸銨對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響最大，蔗糖次之，酵母粉的影響較?。?/p>

表4 正交實(shí)驗(yàn)Tab.4 Orthogonal test

優(yōu)化后的最適發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L)：蔗糖 10、酵母粉 10、硫酸銨 6和 NaCl 10．由圖 1可知，重組E.coli BL21在最適發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況良好，而且AIM 的表達(dá)量達(dá) 1.775 g/L，是在原始培養(yǎng)基中表達(dá)量的1.247倍．

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化前后的生物量及AIM的表達(dá)量Fig.1 Biomass and expression levels for fermentation medium optimization

2.2 發(fā)酵條件

2.2.1 裝液量

由圖2可知，裝液量對(duì)AIM表達(dá)量的影響較大，在 10～30,mL時(shí) AIM 表達(dá)量逐漸升高，在 40～60,mL時(shí) AIM 表達(dá)量嚴(yán)重下降，表明充足的氧供應(yīng)是菌體生長(zhǎng)和高表達(dá) AIM 的必需條件．因此，發(fā)酵時(shí)裝液量應(yīng)控制在30,mL．

圖2 裝液量對(duì)AIM表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of media volume on the expression of AIM

2.2.2 接種量

接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種的生長(zhǎng)繁殖速度，較大的接種量可以縮短菌體繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長(zhǎng)機(jī)會(huì)．但接種量過大或者過小，均會(huì)影響發(fā)酵．過大會(huì)引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成，而且會(huì)過多產(chǎn)生代謝廢物；過小會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，降低生產(chǎn)率．由圖 3可知，接種量為8%時(shí)AIM表達(dá)量最高．

圖3 接種量對(duì)AIM表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of inoculum size on the expression of AIM

2.2.3 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)

誘導(dǎo)時(shí)機(jī)是影響 AIM 表達(dá)量的重要工藝參數(shù)．由圖 4可知，在 A600為 1.0 時(shí)誘導(dǎo)，AIM 的表達(dá)量最高．

圖4 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)AIM表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of induction opportunity on the expression of AIM

2.2.4 誘導(dǎo)劑量

工程菌中的表達(dá)載體為 IPTG誘導(dǎo)型表達(dá)載體，因此 AIM 的表達(dá)必須加入 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)．由圖 5可知，終濃度0.8,mmol/L的IPTG誘導(dǎo)效果最佳．

圖5 誘導(dǎo)劑量對(duì)AIM表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of induction concentration on the Expression Fig.5 of AIM

2.2.5 誘導(dǎo)時(shí)間

由圖6可知，隨著誘導(dǎo)時(shí)間從3,h到6,h，AIM表達(dá)量逐漸增加并達(dá)到最高，繼續(xù)增加誘導(dǎo)時(shí)間，AIM并沒有發(fā)生降解．因此，選擇誘導(dǎo)時(shí)間為6,h．

圖6 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)AIM表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of induction time on the expression of AIM

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過對(duì)重組大腸桿菌BL21/pET22b-AIM發(fā)酵條件的研究，確定其最適發(fā)酵條件為：裝液量30 mL，接種量8%，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)A6001.0，誘導(dǎo)濃度0.8 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間 6 h．發(fā)酵后的蛋白樣品經(jīng) SDS-PAGE電泳后，在 28.0 ku有清晰明顯條帶(如圖 7所示)，和AIM的結(jié)果一致．由圖8可知，在最適發(fā)酵培養(yǎng)基和最適發(fā)酵條件下AIM的表達(dá)量可達(dá)2.26 g/L，是優(yōu)化前的1.58倍．

圖7 發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化前后的SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE for fermentation medium and fermentation conditions optimization

圖8 最適發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下的生物量及AIM表達(dá)量Fig.8 Biomass and expression level in optimized fermentation medium and conditions

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)基于微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)利用情況及成本的比較，運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)和 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)篩選出最適發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L)：蔗糖 10，酵母粉 10，硫酸銨 6和NaCl 10；單因素實(shí)驗(yàn)篩選出最適發(fā)酵條件為：裝液量30,mL，接種量 8%，誘導(dǎo)時(shí)機(jī) A6001.0，誘導(dǎo)濃度 0.8 mmol/L，37,℃、200,r/min 誘導(dǎo) 6,h，AIM 的表達(dá)量達(dá)2.26,g/L，是未優(yōu)化條件下的1.58倍．

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