馬 雷，程立坤，徐慶陽，陳 寧

(1. 天津科技大學(xué)電子信息與自動化學(xué)院，天津 300222；2. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

L–異亮氨酸(Ile)是人體8種必需氨基酸之一，又是3種支鏈氨基酸之一，因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能而在人類生命代謝中具有特別重要的地位．L–異亮氨酸除用于一般營養(yǎng)型復(fù)合氨基酸輸液，還大量用于配制治療型特種氨基酸輸液如肝安、腎安氨基酸輸液，對治療各種肝臟疾病具有顯著療效[1]．隨著 L–異亮氨酸市場需求量的增加，人們對發(fā)酵生產(chǎn) L–異亮氨酸進(jìn)行了深入研究．代謝流分析(Metabolic Flux Analysis，MFA)定量地描述了代謝網(wǎng)絡(luò)中各個支路的流量分配關(guān)系，有助于分析目的產(chǎn)物的合成過程的瓶頸，對于理解細(xì)胞的代謝調(diào)控機制有重要意義．

常高峰等[2]通過對黃色短桿菌生產(chǎn) L–異亮氨酸的發(fā)酵代謝分析得出，在 L–異亮氨酸的發(fā)酵過程中有纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸及乳酸等雜酸積累，副產(chǎn)物的生成造成了碳源的浪費．在生物合成過程中，當(dāng)EMP途徑通量超出 TCA循環(huán)的代謝能力時，會使EMP途徑生成的丙酮酸積累，則會導(dǎo)致酸及副產(chǎn)物的生成．有研究表明[3]，在發(fā)酵過程中添加檸檬酸鈉，可適當(dāng)減少 EMP途徑的代謝流量，降低副產(chǎn)物的生成．本文考察了添加不同濃度的檸檬酸鈉對 L–異亮氨酸發(fā)酵的影響，旨在確定檸檬酸鈉最適的添加量；并采用代謝流分析方法，定量地描述了檸檬酸鈉添加前后黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)WYJ1合成L–異亮氨酸代謝流的分布．這有利于采取相應(yīng)措施，改造菌種及優(yōu)化發(fā)酵過程控制，為進(jìn)一步提高 L–異亮氨酸的得率提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)WYJ1(Met-＋AECr＋α-ABr)為天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏菌種．

培養(yǎng)基組成參見文獻(xiàn)[4]．

1.1.2 主要儀器

發(fā)酵罐(5 L、30 L全自動發(fā)酵罐)，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA–40C型生物傳感儀，山東科學(xué)院生物研究所；pH電極和溶氧電極，Mettler Toledo；Agilent 1200型高效液相色譜儀，Agilent Technologies；DZF–6020型真空干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司；FA2204B型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司．

1.2 培養(yǎng)方法

斜面菌種活化培養(yǎng)：取斜面保藏菌種劃線接種于活化斜面，31,℃恒溫培養(yǎng)24,h．

5,L種子罐培養(yǎng)：吸取適量無菌生理鹽水于 5支活化斜面中，將所有菌懸液接入 5,L種子罐中．初始通氣量1,L/min，攪拌轉(zhuǎn)速 300～600,r/min，通過自動流加氨水控制 pH(7.0±0.2)，培養(yǎng)溫度 31,℃，以泡敵消泡，培養(yǎng)10,h后，按10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中．

30,L發(fā)酵罐培養(yǎng)：按 10%接種量將種子液接入30,L發(fā)酵罐中，初始通氣量 2,L/min，攪拌轉(zhuǎn)速400～800,r/min，通過自動流加氨水控制 pH(7.0±0.2)，培養(yǎng)溫度31,℃，以泡敵消泡，發(fā)酵培養(yǎng)65,h．

1.3 分析方法

菌體生物量：菌體生物量以菌體干重(g/L)表示，取10,mL發(fā)酵液，10,000,r/min離心20,min，將菌體用蒸餾水洗滌 2次后置于真空干燥箱中，80,℃干燥至恒質(zhì)量，用分析天平稱量．

溶氧及pH：在線測定．

葡萄糖和乳酸濃度：采用 SBA–40C型生物傳感儀測定．

L–異亮氨酸及其他氨基酸含量：L–異亮氨酸及其他氨基酸含量采用高效液相分析系統(tǒng)測定．色譜分離條件：Agilent C18(150,mm×4.6,mm，3.5,μm)為色譜分離柱，2，4–二硝基氟苯柱前衍生測定，乙腈與NaAc溶液進(jìn)行梯度洗脫，流動相流量 1,mL/min，檢測波長360nm．

1.4 數(shù)據(jù)處理

發(fā)酵過程中菌體比生長速率 μ按照公式(1)計算：

式中：X、x均為菌體量；t為時間．用Origin繪圖軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行微分計算，再用 Excel軟件求解不同時刻的μ．

2 結(jié)果與分析

2.1 L–異亮氨酸生物合成途徑分析

根據(jù)文獻(xiàn)報道[5]，在黃色短桿菌中L–異亮氨酸生物合成的中心代謝途徑包括 EMP、TCA及 HMP途徑，而乙醛酸途徑封閉或微弱．L–異亮氨酸生物合成的代謝網(wǎng)絡(luò)如圖1所示．由圖1可知，由葡萄糖合成L–異亮氨酸的途徑較長且復(fù)雜．王健等[6]通過對 L–異亮氨酸的代謝途徑分析得出：減弱 TCA循環(huán)和乙醛酸支路，可以使更多的碳架流轉(zhuǎn)向異亮氨酸的合成．并且宋文軍等[7]研究表明，在 L–異亮氨酸生物合成中，若 TCA 途徑流量過大，會導(dǎo)致 L–異亮氨酸的代謝流減少．故減弱 TCA途徑，可以提高發(fā)酵過程中 L–異亮氨酸產(chǎn)酸水平．Majewsi和 Domach[8]用限制性網(wǎng)絡(luò)分析和相關(guān)酶活相關(guān)聯(lián)的代謝流，指出在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中EMP途徑相對于TCA循環(huán)要過量，當(dāng)EMP途徑通量超出TCA循環(huán)的代謝能力時，致使EMP途徑生成的丙酮酸積累，且會通過其他途徑進(jìn)行代謝以緩解持續(xù)的“溢流”，導(dǎo)致酸及副產(chǎn)物的生成．有研究表明[3]，在利用黃色短桿菌發(fā)酵生產(chǎn) L–亮氨酸過程中，當(dāng) EMP途徑流量超出 TCA及 L–亮氨酸生物合成的代謝能力時，丙酮酸代謝受阻，從而通過其他途徑進(jìn)一步代謝，導(dǎo)致副產(chǎn)物生成．因此，發(fā)酵生產(chǎn)L–異亮氨酸的過程中，減弱EMP途徑代謝流量，降低副產(chǎn)物的生成及控制 TCA循環(huán)流量，是提高 L–異亮氨酸得率的關(guān)鍵．劉新星等[9]通過研究檸檬酸鈉對枯草芽孢桿菌生產(chǎn)肌苷的影響得出，添加檸檬酸鈉可以顯著降低丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活力，從而減弱 EMP途徑通量．同時，檸檬酸鈉會競爭性抑制檸檬酸合成酶的活性．因此，在L–異亮氨酸發(fā)酵過程中添加檸檬酸鈉，可有效減弱EMP途徑及TCA循環(huán)的代謝流量．

圖1 黃色短桿菌L–異亮氨酸生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Biosynthesis metabolism pathway of L-isoleucine in Fig.1 Brevibacterium flavum

2.2 檸檬酸鈉對L–異亮氨酸發(fā)酵的影響

2.2.1 檸檬酸鈉對發(fā)酵副產(chǎn)物的影響

宋翔等[10]研究表明，在谷氨酸發(fā)酵中添加檸檬酸鈉可適當(dāng)減少 EMP途徑的代謝流量，降低副產(chǎn)物乳酸、L–丙氨酸、L–賴氨酸的生成．L–異亮氨酸屬天冬氨酸族，又是分支鏈氨基酸，其生物合成存在嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)反饋調(diào)節(jié)抑制，不可能過量積累，且復(fù)雜的調(diào)控機制使得 L–異亮氨酸發(fā)酵產(chǎn)物中存在有機酸及其他氨基酸等副產(chǎn)物．發(fā)酵過程中副產(chǎn)物的生成造成了碳源的浪費及 L–異亮氨酸合成流量的減少．因此，減少副產(chǎn)物的生成可有效提高 L–異亮氨酸產(chǎn)率．分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L 的檸檬酸鈉進(jìn)行 L–異亮氨酸分批發(fā)酵，發(fā)酵過程中副產(chǎn)物含量如圖2所示．由圖2可知，在L–異亮氨酸發(fā)酵過程中添加檸檬酸鈉可有效減少副產(chǎn)物的生成，且隨著檸檬酸鈉添加量的增加，副產(chǎn)物含量逐漸降低，但是降低幅度逐漸減?。?/p>

圖2 檸檬酸鈉對L–異亮氨酸發(fā)酵副產(chǎn)物的影響Fig.2 Effect of sodium citrate on byproducts of Fig.歡會 L-isoleucine fermentation

2.2.2 檸檬酸鈉對菌體比生長速率及生物量的影響

檸檬酸鈉對生物合成途徑中關(guān)鍵酶如磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶及檸檬酸合成酶等存在抑制作用，則在發(fā)酵過程中添加檸檬酸鈉會抑制菌體生長[9]．在L–異亮氨酸分批發(fā)酵中，檸檬酸鈉對菌體生長的影響如圖3所示．

圖3 檸檬酸鈉對菌體比生長速率及生物量的影響Fig.3 Effect of sodium citrate on the specific growth rate Fig.3 and biomass

由圖 3可知，檸檬酸鈉添加量為 1.0、2.0,g/L與未添加時，菌體比生長速率及生物量差異不大．而添加量為3.0,g/L時，菌體比生長速率及生物量降低，且隨著添加量的增加逐漸降低．

2.2.3 檸檬酸鈉對L–異亮氨酸產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加檸檬酸鈉可減少副產(chǎn)物生成，即副產(chǎn)物的代謝流量減少可使 L–異亮氨酸的代謝流量增加．有研究表明[10]，向L–谷氨酸發(fā)酵過程中添加檸檬酸鈉，可增加 L–谷氨酸生物合成的代謝流，提高 L–谷氨酸產(chǎn)酸水平．而谷氨酸是異亮氨酸合成的前體物，則谷氨酸的增加利于 L–異亮氨酸的合成．發(fā)酵過程中添加檸檬酸鈉對 L–異亮氨酸產(chǎn)量的影響如圖4所示．

圖4 檸檬酸鈉對L–異亮氨酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of sodium citrate on the yield of L-isoleucine

由圖4可知，當(dāng)檸檬酸鈉添加量為2.0,g/L時，產(chǎn)酸水平最高，為25.63,g/L，與未添加相比提高了 7.87%．但是檸檬酸鈉添加量高于 3.0,g/L時，L–異亮氨酸產(chǎn)酸水平逐漸下降，這可能是檸檬酸鈉對生物合成途徑中關(guān)鍵酶的抑制作用造成的．

綜上所述，當(dāng)檸檬酸鈉添加量為 2.0,g/L，可有效減少發(fā)酵過程中副產(chǎn)物的生成，且對 L–異亮氨酸生產(chǎn)菌的生長影響較小，同時使 L–異亮氨酸的產(chǎn)量得到提高．故在 L–異亮氨酸發(fā)酵中，檸檬酸鈉的最適添加量為2.0,g/L．

2.3 檸檬酸鈉添加前后代謝流量分析

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加或未添加 2.0,g/L檸檬酸鈉，分別對其發(fā)酵中后期進(jìn)行代謝流量分析．由圖 3可知，L–異亮氨酸發(fā)酵過程中 36,h后菌體干重基本沒有變化，說明發(fā)酵進(jìn)入中后期．測定36～60,h葡萄糖、4 種氨基酸(L–異亮氨酸、L–纈氨酸、L–亮氨酸、L–丙氨酸)和乳酸的含量，并對其變化速率和代謝流進(jìn)行計算，結(jié)果見表1．

表1 檸檬酸鈉添加前后代謝產(chǎn)物變化速率及代謝流量Tab.1 Variation rate and metabolic flux of metabolites without or with sodium ciltrate

由表 1可以看出，添加檸檬酸鈉后，降低了副產(chǎn)物 L–纈氨酸、L–亮氨酸、L–丙氨酸及乳酸的代謝流量，提高了L–異亮氨酸的代謝流量．同時，加入檸檬酸鈉以后，葡萄糖的消耗速率降低，這與文獻(xiàn)[9]所得出的結(jié)論“檸檬酸鈉降低了枯草芽孢桿菌的耗糖速率”相一致．但是，L–異亮氨酸的生成速率增加，這說明加入檸檬酸鈉可以提高 L–異亮氨酸發(fā)酵中的糖酸轉(zhuǎn)化率．

利用MATLAB軟件中的Linprog函數(shù)計算得到檸檬酸鈉添加前后 L–異亮氨酸發(fā)酵中后期的代謝流量分布，其結(jié)果分別如圖5和圖6所示．

由圖 5和圖 6可知，添加檸檬酸后生成副產(chǎn)物Val、Leu、Ala及 Lac的代謝流均有所降低，分別降低了40.91%、14.26%、48.84%、8.78%．而進(jìn)入L–異亮氨酸生物合成途徑的代謝流較未添加前提高了 5.91%．由于分支鏈氨基酸的合成需要谷氨酸提供氨基，則谷氨酸合成的代謝流量較大．未添加檸檬酸鈉時進(jìn)入HMP、EMP的代謝流量分別為 36.66、63.34，添加后HMP途徑的代謝流量為 53.46，EMP代謝流量為46.54．則可知，添加檸檬酸鈉可以減弱 EMP途徑代謝流量，增加 HMP途徑代謝流量，這與文獻(xiàn)[3]報道的檸檬酸鈉對產(chǎn) L–亮氨酸黃色短桿菌代謝流分布的影響作用一致．HMP途徑的主要作用是L–異亮氨酸合成途徑提供還原力 NADPH．HMP途徑流量增加，從而還原力 NHDPH 生成量增加，有利于 L–異亮氨酸的合成．檸檬酸鈉添加后，TCA循環(huán)的代謝流量有所降低，由于檸檬酸鈉合成酶是TCA循環(huán)的限速酶，添加檸檬酸鈉會對檸檬酸鈉合成酶活性產(chǎn)生抑制作用．因此，在 L–異亮氨酸發(fā)酵過程中添加檸檬酸鈉，可有效減弱EMP途徑及TCA循環(huán)的代謝流量，減少副產(chǎn)物的生成及提高 L–異亮氨酸合成的代謝流量，有利于L–異亮氨酸發(fā)酵．

圖5 未添加檸檬酸鈉時L–異亮氨酸合成代謝流量分布Fig.5 Metabolic flux distribution of L-isoleucine fermen-Fig.5 tation without addition of sodium citrate

圖6 添加檸檬酸鈉后L-異亮氨酸合成代謝流量分布Fig.6 Metabolic flux distribution of L-isoleucine fermen-Fig.6 tation with addition of sodium citrate

3 討 論

代謝網(wǎng)絡(luò)是一個復(fù)雜的反應(yīng)體系，要提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)率，中心代謝途徑與產(chǎn)物合成途徑所組成的代謝網(wǎng)絡(luò)的限速反應(yīng)是關(guān)鍵．王健等[6]對 L–異亮氨酸的代謝途徑進(jìn)行分析，通過對基本模型的分析，確定了 L–異亮氨酸生物合成最優(yōu)的代謝途徑．通過引導(dǎo)最優(yōu)途徑中各個關(guān)鍵酶成比例的過量表達(dá)，在不破壞整個代謝途徑的情況下，可提高 L–異亮氨酸產(chǎn)率，防止碳源的浪費．在代謝途徑分析的指導(dǎo)下，通過優(yōu)化培養(yǎng)基及控制工藝條件，使 L–異亮氨酸產(chǎn)酸水平得到提高．經(jīng)酶學(xué)性質(zhì)研究表明[9]，檸檬酸鈉的添加降低了EMP途徑中關(guān)鍵酶PFK和PK的活力，從而引起糖酵解過程酶反應(yīng)速率減慢，通量減少，同時 HMP途徑的關(guān)鍵酶 6–磷酸葡萄糖脫氫酶的活力有所增加．則在 L–異亮氨酸發(fā)酵中添加檸檬酸鈉可以減弱EMP途徑，且可以增加還原力NADPH的供應(yīng)，有利于提高 L–異亮氨酸的產(chǎn)率．本文利用代謝流分析法分析 L–異亮氨酸發(fā)酵中后期的代謝流量分布，可為菌株構(gòu)建及發(fā)酵工藝研究提供理論依據(jù)，對 L–異亮氨酸規(guī)?；a(chǎn)有一定指導(dǎo)意義．

［1］ 宋文軍，陳寧，魏春，等. 基于代謝流導(dǎo)向與分析的 L–異亮氨酸發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2003，18(2)：15-19.

［2］ 常高峰，陳寧. L–異亮氨酸發(fā)酵代謝分析[J]. 生物技術(shù)通訊，2003，14(6)：502-505.

［3］ 陳寧，劉輝. 檸檬酸鈉對 L-亮氨酸發(fā)酵代謝流分布的影響[J]. 高?；瘜W(xué)工程學(xué)報，2008，22(3)：478-482.

［4］ 陳寧，常高峰，張克旭. L–異亮氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面法優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(2)：33-37.

［5］ Pharkya P，Burgard A P，Maranas C D. Exploring the overproduction of amino acid using the bilevel optimization framework opt knock[J]. Biotechnol Bioeng，2003，84(7)：887-899.

［6］ 王健，王志誠，田梁邐霞，等. 產(chǎn)生 L–異亮氨酸的黃色短桿菌的代謝途徑分析[J]. 生物技術(shù)通訊，2006，17(4)：593-596.

［7］ 宋文軍，張克旭，張坤生，等. 不同供氧條件對 L–異亮氨酸合成代謝流的影響[J]. 中國食品學(xué)報，2003，3(1)：1-6.

［8］ Majewsi R A，Domach M M. Simple constrained-optimization view of acetate overflow in E. coli[J]. Biotechnology and Bioenineering，1990，35(7)：732-738.

［9］ 劉新星，陳雙喜，儲炬，等. 檸檬酸鈉對枯草芽孢桿菌生長代謝及肌苷積累的影響[J]. 微生物學(xué)報，2004，44(5)：627-630.

［10］ 宋翔，謝希賢，徐慶陽，等. 檸檬酸鈉對 L-谷氨酸發(fā)酵代謝流遷移的影響[J]. 天津科技大學(xué)學(xué)報，2009，24(2)：5-8.