鄭紹軍,李 靜,曾 麗,趙彩云

(廣安市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所,四川 廣安 638000)

微小果核上人體脫落細胞DNA檢驗

鄭紹軍,李 靜,曾 麗,趙彩云

(廣安市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所,四川 廣安 638000)

本文作者結(jié)合實際檢案工作對微小果核上微量脫落細胞采用直接剝離果核種皮、剪碎、浸泡、反復(fù)多倍純水稀釋、震蕩、離心收集脫落細胞,通過固液分離、超純水清洗、離心等手段消除一些PCR的抑制因素,采用Chelex法聯(lián)合Q IAGEN試劑盒聯(lián)合提取純化濃縮DNA模板,適當(dāng)增加PCR循環(huán)數(shù),明顯提高了微小果核上微量脫落細胞的檢出成功率。

法醫(yī)物證學(xué);微小果核物證;DNA檢驗;微量脫落細胞

在現(xiàn)代犯罪行為中,現(xiàn)場物證呈現(xiàn)出多樣化、微量化的發(fā)展趨勢。在筆者接觸的多起殺人、盜竊案件中,果核均成為案發(fā)現(xiàn)場提取的唯一生物檢材。微量生物檢材上粘附的脫落細胞數(shù)量有限,使得現(xiàn)場的PCR抑制因素更加突出,因此在提取微量生物檢材上脫落細胞時應(yīng)盡量多收集,至少達到足夠一次PCR的細胞量。目前提取果核上脫落細胞常采用雙棉簽法或絲線擦拭法。該方法主要是針對體積較大的果核,對桔子、柚子核等微小果核提取效果較差。筆者結(jié)合一例入室搶劫殺人案介紹微小果核上人體脫落細胞DNA檢驗。

1 案例資料

2009年12月,四川某縣江某(男,78歲)被殺死在自己家中。在死者家2樓及3樓堆放的油菜稈中提取桔子核及皮若干。實驗室受理后,將剝下的桔子核種皮剪碎、浸泡、反復(fù)多倍純水稀釋、震蕩、離心收集脫落細胞,采用chelex法聯(lián)合Q IAGEN試劑盒提取檢驗,獲得完整DNA圖譜。經(jīng)比對分析,桔子核種皮上脫落細胞DNA分型與嫌疑人一致。

2 試劑及儀器設(shè)備

試劑:5%Chelex-100(5g 200-400目的Chelex-100 100ml超純水)、PK10mg/ml、Q IAGEN試劑盒、Sinofiler復(fù)合擴增試劑盒。

儀器:3130型基因分析儀、9700型PCR擴增儀。

3 檢材情況

所送現(xiàn)場提取得桔子核共7粒,外表較干燥,不同程度粘附有柴草、灰塵、沙礫。

3.1 DNA提取:方法1:取2粒桔子核,用干棉簽輕輕拭掉上面的灰塵、草屑,然后先用適度濕潤的紗線用力擦拭果核表面一遍,再用干紗線再用力擦拭一遍。將兩次擦拭紗線置于1.5mlEP管內(nèi),采用《GA/T383-2002法庭科學(xué)DNA實驗室檢驗規(guī)范》中chelex法處理,加入80ul chelex-100,并加入10mg/mlPK,使之終濃度達到200ug/ml,56℃消化60分鐘以上,100℃煮沸8分鐘;震蕩后13000rpm離心5分鐘,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

方法2:取2粒桔子核,用干棉簽輕輕拭掉上面的灰塵、草屑,剝除桔子核種皮,剪碎,置入1.5mlEP管內(nèi),純水1000ul浸泡15分鐘以上,期間吹打并高速震蕩,13000r/min離心5分鐘,去上清。再次加入純水1000ul稀釋高速震蕩,13000rpm離心5分鐘,重復(fù)該操作3-5次。采用chelex法處理,加入80ul chelex-100,并加入10mg/mlPK,使之終濃度達到200ug/ml,56℃消化60分鐘以上,100℃煮沸8分鐘;震蕩后13000rpm離心5分鐘,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

方法3:取2粒桔子核,處理方法同方法2。取chelex法處理后的DNA上清液(全部吸盡,盡量不要吸到珠子),使用Q IAGEN試劑盒中的PB I溶液按體積比5∶1充分混勻,以13000rpm離心過柱子,棄掉下層液體,重復(fù)此操作直到混合液全部濾過,加已配無水乙醇的PE洗滌液500ul,離心洗滌1次,將65℃預(yù)熱的EB洗脫液30ul直接加到純化柱的硅膜上,13000rpm離心2分鐘,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 PCR擴增與檢測:分別取以上三種方法得到的模板DNA,采用10ul擴增反應(yīng)體系,其中Reaction Mix 1.0ul,Gold Tag酶0.3ul,Primer set 1.0ul,模板DNA 1.0ul、1.75ul、2.5ul梯度擴增,用超純水補足體系。根據(jù)Sinofiler復(fù)合擴增試劑盒說明書設(shè)置,置于9700型PCR擴增儀擴增。

擴增產(chǎn)物經(jīng)3130型基因分析儀電泳收集信息,用GeneMapper ID v3.3進行等位基因分析。

3.3 結(jié)論:按照方法1處理桔子核未能得到STR基因座分型圖譜,按照方法2處理桔子核未能得到全位點STR基因座分型圖譜(圖一),按照方法3處理桔子核檢出全部STR基因座分型(圖二)。

4 討 論

4.1 檢材的收集:從載體上提取人體脫落細胞DNA的含量合純度,受個體差異、與載體接觸時間、載體性質(zhì)等諸多因素的影響[1]。桔子核屬于微小果核,果核上脫落細胞量較少,用棉簽或紗線擦拭往往不能得到足夠量的DNA模板,為此筆者采用將果核種皮剝離剪碎浸泡以收集足夠量的脫落細胞,但因受果膠、果酸的影響,剛開始浸泡液十分粘稠,其比重大于細胞,故直接離心不能使脫落細胞沉淀,需要反復(fù)多倍純水稀釋震蕩離心。這是收集脫落細胞的關(guān)鍵。

4.2 檢材DNA提取:Chelex法提取微量生物檢材上細胞DNA的優(yōu)點是操作方便,步驟簡單,整個提取過程在一個離心管中完成,減少了污染的機會,但是單用Chelex法提取缺點也十分明顯,即不能濃縮純化DNA,尤其對微量生物檢材提取成功率低,如上述方法1、2,均未能得到滿意的DNA STR分型。筆者先采用Chelex法提取微量檢材DNA,既可以提取到較多量的模板DNA,又可通過固液分離、超純水清洗、離心等手段初步消除一些PCR的抑制因素,在Chelex法提取基礎(chǔ)上加用Q IAGEN試劑盒往往成功檢出微量檢材DNA STR分型。

4.3 擴增反應(yīng)及檢測:在提取咬過的水果、吃過的果核時,因受果膠、果酸的影響,可以用chelex-100配合Q IAGEN試劑盒提取,建議用25μL全體系擴增,擴增時適當(dāng)增加2-4個循環(huán),循環(huán)數(shù)不要超過32個,否則會出現(xiàn)非特異性擴增或漏擴增,影響結(jié)果判定。對微量DNA進行分析,由于DNA含量少,且受載體介質(zhì)影響,結(jié)果產(chǎn)生不對稱擴增、等位基因丟失或增加等問題,甚至被污染,所以要結(jié)合比對對象,確定結(jié)果是否可采用,無比對對象檢材要進行重復(fù)試驗,基因型相同時才可確定[2]。

4.4 質(zhì)量控制:嚴(yán)格防范在現(xiàn)場勘查或送檢過程中的檢材污染[3],盡可能將相關(guān)人員的DNA數(shù)據(jù)放入質(zhì)控庫。嚴(yán)格執(zhí)行《法庭科學(xué)DNA檢驗規(guī)范操作標(biāo)準(zhǔn)》(GA/T383-2002),避免試驗室內(nèi)污染。實驗中必須設(shè)置陽性對照、陰性對照及試劑對照,以保證檢驗結(jié)果準(zhǔn)確性。

[1] 郭燕霞,陳 松,劉開會,等.人體脫落上皮細胞DNA檢驗2例[J].刑事技術(shù),2007,(1):51-52

[2] 陳 松,李萬水,胡 蘭,等.微量DNA:容易忽略的生物物證[J].刑事技術(shù),2004,(1):19-21

[3] 胡 蘭.法醫(yī)遺傳學(xué)進展與應(yīng)用[M].北京:群眾出版社,2008.29-32

1005-3697(2011)03-0260-02

DF795.4

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2011-04-22

(學(xué)術(shù)編輯:杜 冰)