快速起搏對(duì)家兔心房肌鈣通道表達(dá)的影響及螺內(nèi)酯干預(yù)的研究

王聯(lián)發(fā)，顧 磊，吳振西，羅 駿，張淑華

(1.中國(guó)人民解放軍105醫(yī)院心內(nèi)二科，合肥230001;2.江西省人民醫(yī)院心血管研究所，南昌330006)

心房纖顫(簡(jiǎn)稱(chēng)房顫)是臨床上最常見(jiàn)的持續(xù)性心律失常，可引起心力衰竭、腦卒中等嚴(yán)重的并發(fā)癥，其防治一直是臨床實(shí)踐中的難點(diǎn)。研究證實(shí)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)在房顫的發(fā)生和維持中起重要作用，而心房肌L型鈣離子通道在電重構(gòu)中起著關(guān)鍵作用。本研究通過(guò)人工心臟起搏的方法建立急性家兔房顫模型，檢測(cè)心房肌鈣離子通道α1C亞基及β1的表達(dá)的變化，探討螺內(nèi)酯對(duì)急性房顫心房L型鈣離子通道亞基表達(dá)的影響，從而為螺內(nèi)酯應(yīng)用于臨床防治房顫提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取健康普通家兔18只，雌雄不限，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量2.0～ 3.2 kg。隨機(jī)分為 3組，對(duì)照組、起搏組、螺內(nèi)酯組，各6只。螺內(nèi)酯組以螺內(nèi)酯20 mg/(kg·d)灌胃給藥2周，其余兩組以等容量生理鹽水灌胃2周。

1.2 房顫模型的建立 3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg經(jīng)兔耳緣靜脈注射麻醉后，靜脈推注肝素1000 U;將兔仰臥固定于兔臺(tái)，記錄體表心電圖，頸部正中切口，分離右側(cè)頸內(nèi)靜脈并切開(kāi)，近頭端結(jié)扎，置入1根4F四極電極導(dǎo)管(電極間距5 mm)至右房，插入深度約6 cm，將遠(yuǎn)端電極對(duì)與心電圖左、右手電極相連，心電圖機(jī)調(diào)為Ⅰ導(dǎo)聯(lián)，記錄心內(nèi)雙極導(dǎo)聯(lián)心電圖，示大A小V，表明電極位于右心房，固定好電極導(dǎo)管。經(jīng)耳緣靜脈注射阿托品和美多心安以阻斷自主神經(jīng)對(duì)心率的影響，阿 托 品 首 劑 0.04 mg/kg靜 脈 推 注，以 后0.007 mg/(kg·h)靜脈滴注維持，美多心安首劑0.2 mg/kg，以后 0.02 mg/(kg·h)維持。起搏組和螺內(nèi)酯組采用心臟電生理刺激儀連續(xù)單刺激模式進(jìn)行8 h的快速心房起搏，起搏周長(zhǎng) 100 ms，脈寬0.5 ms，電壓4 V。對(duì)照組植入起搏電極，但不行高位快速右房起搏刺激。

1.3 L型鈣通道α1C、β1亞基mRNA表達(dá)的測(cè)定

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)設(shè)計(jì)要求，應(yīng)用 Primer5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，送上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，引物長(zhǎng)度和反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

表1 引物序列及聚合酶鏈反應(yīng)條件

1.3.2 RNA的提取 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，起搏結(jié)束后，在家兔麻醉的狀態(tài)下，無(wú)菌技術(shù)開(kāi)胸，迅速取出心臟，在無(wú)鈣臺(tái)氏液中漂洗心臟，剪下右心房組織，放入液氮中冷凍保存。將心房組織充分研磨、勻漿，在RNA提取試劑Trizol中充分勻漿，按照Trizol試劑盒操作說(shuō)明提取總RNA，所提RNA溶于30 μL無(wú)酶水中，核酸定量測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和純度，并行質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察RNA的完整性。

1.3.3 心房肌α1C及β1mRNA的檢測(cè) 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)各組心房肌α1C和β1mRNA的變化。將1 μg總RNA按照Promage試劑盒操作步驟行20 μL體系反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所得cDNA作為模板，后續(xù)25 μL體系PCR試驗(yàn)。PCR體系:5 μL cDNA，12.5 μL PCR Master Mix，5.5 μL 無(wú)核酶水，上游及下游引物(10 μmol/L)各1 μL。PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像并測(cè)定吸光度值(A值)，以GAPDH為內(nèi)參照，將Aα1C/AGAPDH以及Aβ1/A GAPDH比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 L鈣通道各亞基mRNA產(chǎn)物的電泳結(jié)果 L鈣通道各亞基mRNA經(jīng)半定量RT-PCR電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，各目的基因和內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增條帶位置和理論值相符。

圖1 L型鈣離子通道α1C和β1的mRNA產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果

2.2 L型鈣通道各亞基mRNA的表達(dá)結(jié)果 快速心房起搏8 h后，心房肌L型鈣通道α1C和β1亞基mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比分別下降22%和26%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而螺內(nèi)酯組下降幅度明顯減少，分別為13%和17%，與起搏組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明螺內(nèi)酯對(duì)快速心房起搏導(dǎo)致的L型鈣離子通道表達(dá)有一定的保護(hù)作用(表2)。

表2 L型鈣通道各亞基mRNA的表達(dá)結(jié)果

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，心房電重構(gòu)在房顫的發(fā)生和維持中起著關(guān)鍵的作用，而L型鈣通道可能是快速心房肌電生理重構(gòu)的始動(dòng)因素。鈣通道離子流是心肌細(xì)胞動(dòng)作電位及其興奮功能的主要組成部分，心肌細(xì)胞有多種Ca2+通道蛋白，其中L型鈣離子通道在心臟復(fù)極中起重要作用，L型鈣通道在動(dòng)作電位初始時(shí)即被激活產(chǎn)生內(nèi)向電流，并延續(xù)整個(gè)平臺(tái)期，所以L型鈣通道功能的變化，都可導(dǎo)致心律失常。Ica-L通道在心房重構(gòu)中起著重要的作用，已經(jīng)在許多動(dòng)物試驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)［1，2］。van der Velden等［3］在山羊模型上同樣觀察到與竇性心律相比，持續(xù)性房顫心房肌的α1C的mRNA表達(dá)顯著降低。國(guó)內(nèi)馬瑞彥等［4］通過(guò)心房快速起搏家兔模型發(fā)現(xiàn)，L型鈣通道亞單位α1C的表達(dá)在快速起搏3 h后無(wú)變化，起搏6 h后表達(dá)明顯下調(diào)17.35%，起搏12 h時(shí)進(jìn)一步下調(diào)。1995年Wijffels等［5］利用快速心房起搏建立房顫的山羊動(dòng)物模型，并發(fā)現(xiàn)心房快速起搏引起的電生理改變與房顫患者相同，奠定了快速心房起搏模型用于房顫發(fā)生機(jī)制研究的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)利用家兔快速心房起搏8 h模擬建立心房纖顫的模型來(lái)觀察L型鈣離子通道的改變。本研究發(fā)現(xiàn)，快速起搏組心房肌L型鈣離子亞基mRNA表達(dá)下降，可引起心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位2相時(shí)程相對(duì)縮短，使該部位心肌復(fù)極相對(duì)加速，從而導(dǎo)致各部位心房肌復(fù)極不一致，容易形成房?jī)?nèi)折返，發(fā)生房性心律失常。螺內(nèi)酯組心房肌細(xì)胞L型亞基mRNA表達(dá)下降幅度減小，提示螺內(nèi)酯可通過(guò)抑制L型鈣通道下降，使動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，使心房肌細(xì)胞電生理活動(dòng)變化減小，減少心律失常發(fā)生，產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。

大量的研究證實(shí)醛固酮在心房重構(gòu)中起著重要的作用。早在20世紀(jì)90年代，Berglund等［6］研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者的血清醛固酮水平明顯高于竇性心律者。Goette等［7］發(fā)現(xiàn)，房顫發(fā)作時(shí)血清醛固酮水平明顯升高，在電復(fù)律48 h后血清醛固酮水平較復(fù)律前顯著下降，而房顫復(fù)發(fā)后血清醛固酮水平又再次升高。Dixen等［8］研究發(fā)現(xiàn)，與竇性心律者相比，房顫患者血漿醛固酮水平明顯升高。醛固酮在房顫中的作用日益引起人們的關(guān)注，以往認(rèn)為使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑或血管及張素受體拮抗劑類(lèi)藥物就能有效抑制醛固酮的作用，然而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，由于“醛固酮逃逸”現(xiàn)象的存在，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑類(lèi)藥物并不能完全長(zhǎng)期抑制醛固酮的產(chǎn)生。醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯作為利尿劑在臨床上廣泛應(yīng)用于心力衰竭、高血壓等疾病的治療，在實(shí)驗(yàn)中觀察到螺內(nèi)酯雖然能夠在一定程度上降低快速心房起搏家兔心房肌細(xì)胞的L型鈣通道亞基mRNA下降的趨勢(shì)，但是僅僅研究了螺內(nèi)酯對(duì)急性房顫L型鈣通道亞基具有一定的保護(hù)作用，是否對(duì)慢性房顫也具有類(lèi)似效果，還需要進(jìn)一步探討。相信，隨著對(duì)醛固酮受體拮抗劑在房顫中作用研究的深入，醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯有可能成為未來(lái)逆轉(zhuǎn)心房重構(gòu)，降低心房纖顫的發(fā)生率，防止心房纖顫復(fù)發(fā)的重要措施之一。

［1］Yue L，F(xiàn)eng J，Gadpo R，et al.Ionic remodeling underlying action potential changes in a caninemodel of atrial fibrillation［J］.Circ Res，1997，81(4):515-525.

［2］Van Gelder IC，Brundel BJM，Henning RH，et al.Alterations in gene expression of protein involved in calcium handling in patients with atrial fibrillation［J］.J Cardiovasc Electrophysiol，1999，10(6):947-953.

［3］van der Velden HMW，van der Zee L，Wijffels MC，et al.Atrial fibrillation in the goat induces changes in monophasic action potential and mRNA expression of ion channels involved in repolarization［J］.Cardiovasc Electrophysiol，2000，11(11):1262-1269

［4］馬瑞彥，肖穎彬，陳勁進(jìn).快速心房起搏對(duì)家兔心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及L-型鈣通道表達(dá)的影響［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86(27):1926-1928.

［5］Wijffels MC，Kirchhof CJ，Dorland R，et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats［J］.Circulation，1995，92(7):1954-1968.

［6］Berglund H，BoukterS，Theodorsson E，et al.Raised plasma concentrations of atrial natriuretic peptide are independent of left atrial dimensions in patients with chronic atrial fibrillation［J］.Br Heart J，1990，64(1):9-13.

［7］GoetteA，HoffmannsP，EnayatiW，et al.Effectof successful electrical cardioversion on serum aldosterone in patients with persistent atrial fibrillation［J］.Am J Cardiol，2001，88(8):906-909.

［8］Dixen U，Ravn L，Soeby-Rasmussen C，et al.Raised plasma aldosterone and natriuretic peptides in atrial fibrillation［J］.Cardiology，2007，108(1):35-39.