覃海茂, 姜志梅, 郭嵐敏, 張虎

宮內(nèi)感染是絨毛膜羊膜炎及胎膜早破的最主要原因,也是腦室周圍白質(zhì)軟化(periventricular leukom alacia,PV L)和腦性癱瘓(cerebral palsy,CP)發(fā)生的主要原因之一。伴隨炎癥反應(yīng)的神經(jīng)膠質(zhì)增生中存在幾種化學(xué)介質(zhì),通過(guò)破裂的血腦屏障刺激了局部硫酸軟骨素糖蛋白多糖(chond roitin sulfate proteoglycans,CSPGs)表達(dá)增多。神經(jīng)蛋白聚糖(Neurocan)和多功能蛋白聚糖(Versican)是CSPGs的兩個(gè)大亞類分子。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR檢測(cè)宮內(nèi)感染致腦損傷新生大鼠腦白質(zhì)區(qū)Neurocan和Versican在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá),探討Neurocan和Versican在中樞神經(jīng)損傷與修復(fù)、神經(jīng)元相互作用和功能重組的機(jī)制,有助于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的康復(fù)治療。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)成熟W istar雌性大鼠40只,雄性大鼠10只,體質(zhì)量180～240 g,由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(黑動(dòng)字第99102001)。

1.2 藥品與試劑 Neurocan引物、Versican引物、溴乙錠(上海生物工程有限公司),Co lum n A nimal RNAOUT(北京天恩澤公司),PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM II、Rnase 抑制劑(TAKARA公司),瓊脂糖(美國(guó)Sigm a公司),Taq DNA聚合酶、100 bp M arker(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.3 模型制作與分組 于17時(shí)以4∶1合籠,次日上午8時(shí)查陰道涂片,以查得精子為妊娠第0天,孕鼠另籠飼養(yǎng)。40只受孕母鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)和脂多糖組(n=30),給予受孕18 d的脂多糖組孕鼠脂多糖(血清型055)380μg/kg,連續(xù)2 d腹腔注射,對(duì)照組孕鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水。觀察兩組孕鼠的分娩時(shí)間,去除早產(chǎn)鼠(孕22 d前分娩)。仔鼠出生后,取胎盤做蘇木精-伊紅(HE)染色觀察宮內(nèi)感染情況。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 HE染色觀察新生大鼠腦白質(zhì)病理學(xué)改變 大鼠腦白質(zhì)經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋后,將蠟塊行冠狀切片(5μm)置于經(jīng)APES防脫片劑處理的載玻片上,經(jīng)脫蠟、HE染色、二甲苯透明,光鏡觀察病理改變。

1.4.2 熒光定量RT-PCR檢測(cè)Neurocan m RNA和Versican mRNA Neurocan(77 bp)上游引物:5'-ACC TGG TAA CCC TGG AAG TGA-3'下游引物:5'-AGCGAA GGT CAA CGC ATA GC-3';Versican(90 bp)上游引物:5'-GCC ATC GAC AGC CTT CAC AG-3'下游引物:5'-CTC ACT GGG CTC CTTCTC AAA G-3';β-actin(150 bp)上游引物:5'-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3',下游引物:5'-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3'。取500 ng cDNA依次梯度稀釋1倍、10倍、102倍、103倍、104倍,分別作為模板按照以下反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增,7300 PCR儀自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)R2值檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的可行性。每一個(gè)待測(cè)指標(biāo)對(duì)應(yīng)一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,且標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板來(lái)自同一管cDNA。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)資料以 x±s表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn);對(duì)所有結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)后,進(jìn)行方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕鼠分娩及仔鼠的一般情況 對(duì)照組孕鼠均順利生產(chǎn),孕鼠無(wú)死亡及提前分娩,共娩出活產(chǎn)足月仔鼠124只;脂多糖組中孕鼠5只死亡,6只提前分娩,剩余19只共娩出活產(chǎn)足月仔鼠132只,死亡24只。足月仔鼠出生后顏色淡紅,體質(zhì)量正常。早產(chǎn)仔鼠顏色青紫、精神萎靡、進(jìn)食減少、行動(dòng)遲緩、活動(dòng)減少、體質(zhì)量低。

2.2 仔鼠腦白質(zhì)病理學(xué)改變 各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組腦白質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常,輪廓清晰,核仁核膜明顯,大小無(wú)變化,未見(jiàn)明顯損傷性改變。脂多糖組0 d可見(jiàn)腦白質(zhì)區(qū)內(nèi)細(xì)胞胞體腫脹、細(xì)胞稀疏、間隙增寬,1 d毛細(xì)血管擴(kuò)張,神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、結(jié)構(gòu)不清,7 d出現(xiàn)少量神經(jīng)細(xì)胞腫脹、數(shù)量略有減少,細(xì)胞皺縮,14 d可見(jiàn)明顯的毛細(xì)血管擴(kuò)張,腦室內(nèi)出血,壞死灶中可見(jiàn)較多的膠質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞核固縮、核碎裂明顯,21 d可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞大多數(shù)壞死,周邊有膠質(zhì)細(xì)胞增生,28 d腦室旁白質(zhì)呈篩網(wǎng)狀壞死。

2.3 兩組不同時(shí)間點(diǎn)Neurocan和Versican m RNA比較 脂多糖組0,1,7,14,21,28 d Neurocan m RNA相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。脂多糖組Neurocan m RNA相對(duì)表達(dá)在1 d升高顯著,7 d達(dá)高峰,28 d仍高于對(duì)照組(P<0.05)。脂多糖組0,1,7,14,21,28 d Versican m RNA相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。脂多糖組Versican m RNA相對(duì)表達(dá)在7～14 d達(dá)高峰,21～28 d逐漸下降,但仍高于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)兩組Neurocan和Versican mRNA相對(duì)表達(dá)量比較( x±s,n=10)

表 1結(jié)果表明,兩組 Neurocan和 Versican mRNA表達(dá)不同時(shí)間點(diǎn)間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。脂多糖組Neurocan mRNA表達(dá)0,1,14,21 d時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Versican mRNA表達(dá)0 d與1 d,1 d與7 d,14 d與21 d,21 d與28 d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床資料均證明感染、炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦白質(zhì)損傷的重要因素。Dammann等[1]發(fā)現(xiàn)胎盤感染的新生兒發(fā)生PVL和腦室擴(kuò)大的危險(xiǎn)性增加60%～70%。此后,研究人員 Bell等[2]通過(guò)在受孕大鼠注射脂多糖建立的動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)感染能導(dǎo)致仔鼠腦白質(zhì)損傷。外傷性腦損傷和高血壓腦卒中也會(huì)引起腦白質(zhì)發(fā)生改變,但這類損傷機(jī)制在時(shí)間和空間上與腦性癱瘓發(fā)病機(jī)制截然不同。本實(shí)驗(yàn)HE染色結(jié)果示脂多糖組0 d可見(jiàn)腦白質(zhì)區(qū)內(nèi)細(xì)胞胞體腫脹、細(xì)胞稀疏、間隙增寬;1 d腦白質(zhì)區(qū)內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張,神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、結(jié)構(gòu)不清、核固縮變圓;7 d腦白質(zhì)區(qū)內(nèi)出現(xiàn)少量神經(jīng)細(xì)胞腫脹、淡染,神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量略有減少,細(xì)胞皺縮;14 d可見(jiàn)明顯的毛細(xì)血管擴(kuò)張,腦室內(nèi)出血,壞死灶中可見(jiàn)較多的少突膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞核固縮、碎裂明顯;21 d可見(jiàn)部分細(xì)胞核濃縮、碎裂結(jié)構(gòu)消失,神經(jīng)細(xì)胞大多數(shù)壞死,嗜伊紅深染,周邊有膠質(zhì)細(xì)胞增生;28 d腦室旁白質(zhì)呈篩網(wǎng)狀壞死。

Neurocan是神經(jīng)組織中硫酸軟骨素蛋白聚糖中一種重要物質(zhì),主要來(lái)源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。Neurocan與神經(jīng)細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞外基質(zhì)和生長(zhǎng)因子相互作用,參與細(xì)胞轉(zhuǎn)移和細(xì)胞增殖。大量證據(jù)表明,從kainite誘發(fā)癲癇開(kāi)始,外傷性病變、局灶性腦缺血性發(fā)作等各種中樞神經(jīng)損傷后出現(xiàn)Neurocan重現(xiàn)和積累[3]。Versican也是CSPGs家族成員之一,主要來(lái)源于少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞。通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn),用單面刀缺損大腦皮質(zhì)后7 d凍存標(biāo)本Versican在損傷周圍顯著增加;采用Western blot分析比較損傷與未損傷組織,發(fā)現(xiàn)損傷組織中有大量Versican。人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Neurocan表達(dá)在胎兒期達(dá)到高峰,在兒童期有全段和部分片段的神經(jīng)蛋白聚糖鏈,而在成年期只有部分片段的糖鏈。當(dāng)成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,又可有全長(zhǎng)的糖鏈出現(xiàn),由此可見(jiàn),中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerve system,CNS)損傷后,損傷位點(diǎn)蛋白表達(dá)上調(diào)[4]。由于受到發(fā)育調(diào)節(jié),Neurocan在胚胎發(fā)育晚期表達(dá)增多但在出生后1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)顯著下降[5]。也有研究認(rèn)為,在正常CNS發(fā)育過(guò)程中,在出生時(shí)Neurocan表達(dá)達(dá)到最高[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組Neurocan表達(dá)在0 d達(dá)到最高水平,而脂多糖組Neurocan相對(duì)表達(dá)在1 d升高顯著,14 d達(dá)高峰,28 d仍高于對(duì)照組(P<0.05)。脂多糖組Versican相對(duì)表達(dá)在7～14 d達(dá)高峰,21～28 d逐漸下降,但仍高于對(duì)照組(P<0.05)。其一,在成年哺乳動(dòng)物中樞損傷部位及炎癥反應(yīng)區(qū),組織損傷和血腦屏障破壞引起局部炎癥細(xì)胞入侵和炎癥因子的釋放導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)分子上調(diào),膠質(zhì)活化啟動(dòng),從而使CSPGs長(zhǎng)時(shí)間大量表達(dá)[7];而這些物質(zhì)與細(xì)胞生物行為密切相關(guān),影響細(xì)胞黏附,調(diào)節(jié)軸突生長(zhǎng),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8]。CSPGs具有調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)和黏附分子以及細(xì)胞支架的組成,參與細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)和物質(zhì)交流,與生長(zhǎng)因子共同影響神經(jīng)元和軸突的生長(zhǎng),以及通過(guò)神經(jīng)元周圍網(wǎng)絡(luò)調(diào)整神經(jīng)細(xì)胞的可塑性[9]。隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟,可塑性也隨著降低。可塑性的關(guān)鍵窗口期通常在生后早期。在發(fā)育早期階段,CSPGs在神經(jīng)元胞體及突觸周圍逐漸形成神經(jīng)元周圍網(wǎng)絡(luò),引起腦的可塑性機(jī)制停止[10]。其二,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在局灶型PV L的早期,腦白質(zhì)區(qū)可見(jiàn)一些炎癥細(xì)胞聚集在壞死區(qū)的周圍,其中大量出現(xiàn)雙核特征的反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞;在 PVL后期,主要以腦室周圍白質(zhì)囊腔存在為特征,神經(jīng)膠質(zhì)增殖及纖維化形成膠質(zhì)瘢痕組織[11]。其三,CSPGs既可以在腦損傷早期由一系列炎癥因子和神經(jīng)介質(zhì)等刺激反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá),又可以在損傷后修復(fù)期存在于膠質(zhì)瘢痕中。其四,正常發(fā)育的腦組織也存在CSPGs兩個(gè)亞型,但中樞神經(jīng)生長(zhǎng)的微環(huán)境處于平衡狀態(tài),其表達(dá)會(huì)受到控制,不會(huì)阻礙神經(jīng)元生長(zhǎng)。因此,在中樞神經(jīng)發(fā)育早期出現(xiàn)的一系列炎癥和免疫反應(yīng)將逐步激活大量反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CSPGs,出現(xiàn)一個(gè)高峰;隨后出現(xiàn)下降,可能與神經(jīng)細(xì)胞損傷后凋亡壞死有關(guān);之后維持在一定水平,可能由于損傷后修復(fù)形成膠質(zhì)瘢痕所致。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂多糖制備宮內(nèi)感染模型,從不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)了解CSPGs表達(dá)變化,根據(jù)CSPGs表達(dá)情況間接說(shuō)明CNS損傷的內(nèi)在機(jī)制,為臨床早期干預(yù)和治療找到一個(gè)恰當(dāng)?shù)摹皶r(shí)間窗”。

CNS損傷后,神經(jīng)元及軸突再生失敗主要由于神經(jīng)再生抑制物質(zhì)的存在。為了建立一個(gè)適合CNS生長(zhǎng)的微環(huán)境,研究人員致力于從CSPGs降解藥物和信號(hào)通路方面探討新的途徑。目前研究比較熱門的幾點(diǎn)如下:采用單劑量到多次注射或使用微泵給硫酸軟骨素ABC降解CSPGs的抑制作用,促使損傷的神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)[12];采用金屬硫蛋白誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞,導(dǎo)致CSPGs表達(dá)下調(diào),此過(guò)程是由JAK/STAT和Rho信號(hào)通路調(diào)控;并且也有人認(rèn)為CSPGs表達(dá)上調(diào),是由MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)[13];研究發(fā)現(xiàn)CSPG的信號(hào)通路與Rho/ROCK通路有關(guān),例如小雞的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元含有神經(jīng)蛋白聚糖底物,可以刺激 GTPase家族的 Rho/ROCK通路[14];除了 Rho-或ROCK-抑制劑,非甾體抗炎藥如布洛芬、消炎痛,通過(guò)抑制RhoA促進(jìn)軸突再生也能顯示出類似的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將布洛芬注射到脊髓損傷區(qū),發(fā)現(xiàn)非甾體抗炎藥能阻止RhoA激活,刺激軸突生長(zhǎng)[15]。此外,CSPGs還可以通過(guò)integrin信號(hào)通路調(diào)節(jié)多功能的神經(jīng)母細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移[16]。

[1] Dammann O,Leviton A.M aternal in trauterine infection,cytokines,and b rain damage in the preterm new born[J].Pediatr Res,1997,42(1):1-8.

[2] Bell M J,Hallenbeck JM.Effects of intrau terine inflamm ation on developing rat brain[J].JNeurosci Res,2002,70(4):570-579.

[3] Shen LH,Li Y,Gao Q,et al.Dow n-regu lation of neurocan expression in reactive astrocy tes promotes axonal regeneration and facilitates the neurorestorative effects of bone m ar row strom al cells in the ischemic rat b rain[J].Glia,2008,56(16):1747-1754.

[4] Tang X,Davies JE,Davies SJ.Changes in distribution cell associations,and protein exp ression levels of NG2,neu rocan,phosphacan,b revican,versican V2,and tenascin-C during acute to ch ronic maturation of spinal cord scar tissue[J].J Neu rosci Res,2003,71(3):427-444.

[5] Meyer-Puttlitz B,Junker E,Margolis RU,et al.Chondroitin sulfate proteoglycans in the developing central nervous system.II.Imm unocytochem ical localization of neu rocan and phosphacan[J].JCom p Neurol 1996,366(1):44-54.

[6] Inatani M,H on jo M,O tori Y,et al.Inhibitory effects of neurocan and phosphacan on neurite outgrow th from retinal ganglion cells in culture[J].Invest Ophthalmol V is Sci,2001,42(8):1930-1938.

[7] Li M,Shibata A,Li C,et al.M yelin-associated glycoprotein inhibits neu rite/axon g row th and causes cone collapse[J].J Neu rosci Res,1996,46(4):404-414.

[8] 李華,范玉華,曹進(jìn)勝.硫酸軟骨素蛋白多糖與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)[J].現(xiàn)代康復(fù),2001,5(11):68-69.

[9] Snow DM,Sm ith JD,Cunningham A T,et al.Neu rite elongation on chond roitin sulfate proteoglycans is characterized by axonal fasciculation[J].Exp Neurol,2003,182(2):310-321.

[10] Pizzorusso T,M edini P,Berardi N,et al.Reactivation of ocular dom inancep lasticity in the adult visual cortex[J].Science,2002,298(5596):1248-1251.

[11] Kadhim H,Tabarki B,Verellen G,et al.Inflammatory cytokines in the pathogenesis of periventricular leukomalacia[J].Neu rology,2001,56(10):1278-1284.

[12] Yick LW,W u W,So KF,et al.Chondroitinase ABC promotes axonal regeneration of Clarke'sneurons after spinal cord injury[J].Neu roreport,2000,11(5):1063-1067.

[13] Leung YK,Pankhu rst M,Dunlop SA.M etallothionein indu ces a regenerative reactive astrocy te phenotype via JAK/STAT and RhoA signalling pathw ays[J].Exp Neu rol,2010,221(1):98-106.

[14] Monnier PP,Sierra A,Schw ab JM,et al.The Rho/ROCK pathway mediates neu rite grow th-inhibitory activity associated w ith the chond roitin su lfate proteoglycans of the CNSg lial scar[J].M ol Cell Neu rosci,2003,22(3):319-330.

[15] Fu Q,Hue J,LiS.Nonsteroidal an ti-inflammatory drugs p romote axon regeneration via RhoA inhibition[J].JNeurosci,2007,27(15):4145-4164.

[16] Gu W L,Fu SL,W ang YX,et al.Chondroitin sulfate p roteoglycans regu late the grow th,differentiation and migration of multipotent neural precu rsor cells through the integrin signaling pathw ay[J].Neuroscience,2009,10(128):1471-2202.