腫瘤抗原細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位鑒定和多肽疫苗的研究進(jìn)展*

吳亞紅，高艷鋒，祁元明

鄭州大學(xué)生物工程系鄭州450001

(2011-07-05收稿 責(zé)任編輯 姜春霞)

惡性腫瘤是當(dāng)前威脅人類生命健康的主要疾病之一，盡管手術(shù)治療聯(lián)合化療/放療能夠延長患者的生存期，但是這些治療手段也會損傷正常細(xì)胞，產(chǎn)生很多不良反應(yīng)，再加上很多惡性腫瘤具有侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等特征，因此，急需發(fā)展新的方法來治療腫瘤患者［1］。隨著人們對免疫系統(tǒng)及其調(diào)節(jié)方式的逐漸認(rèn)識，腫瘤的免疫治療已成為傳統(tǒng)療法的必要補(bǔ)充，由于其不良反應(yīng)小，且能在機(jī)體內(nèi)建立免疫記憶，因此引起了人們的廣泛關(guān)注。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫在抗腫瘤免疫過程中發(fā)揮著主要作用。CTL不僅能通過顆粒酶和穿孔素等物質(zhì)直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還可以通過分泌一些細(xì)胞因子如IFN-γ和TNF-α等間接地殺傷腫瘤細(xì)胞［2］。T細(xì)胞特異性活化的第一步是其表面的 T細(xì)胞受體(Tcellreceptor，TCR)與存在于腫瘤細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞(antigenpresentingcell，APC)表面的抗原肽-MHC(人類MHC稱為HLA)復(fù)合物的特異性結(jié)合，即T細(xì)胞所識別的是腫瘤特異性抗原或相關(guān)抗原中能與相應(yīng)的HLA分子槽狀結(jié)合部位相匹配的稱為抗原表位的小肽片段。因此，尋找能夠激活腫瘤特異性CTL的抗原肽表位一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和前沿課題。研究［3］表明，腫瘤細(xì)胞表面的抗原肽能夠有效地誘導(dǎo)針對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，且抗原肽為基礎(chǔ)的疫苗具有一些獨(dú)特的優(yōu)勢，比如結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物相對簡單、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、安全性高、成本低和制備方便等，此外表位肽還可以通過修飾來提高免疫原性，包括形成多表位疫苗或引入非天然的氨基酸，因此抗原肽疫苗是腫瘤免疫治療的理想候選。但是如何篩選更特異性的腫瘤抗原、提高抗原肽的免疫原性以及選擇更好的佐劑及載體仍然是發(fā)展抗原肽疫苗亟待解決的問題。該文主要就CTL表位肽相關(guān)研究的策略和進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 腫瘤抗原

腫瘤抗原是對細(xì)胞癌變過程中出現(xiàn)的新抗原物質(zhì)的總稱。這些物質(zhì)中的蛋白質(zhì)被降解后產(chǎn)生的一些肽段能夠與MHC分子結(jié)合，并提呈到細(xì)胞表面，成為CTL識別殺傷的靶點(diǎn)［4］。根據(jù)腫瘤抗原特異性的程度將腫瘤抗原分為兩大類:一類是只存在于腫瘤細(xì)胞中而不存在于正常細(xì)胞中的腫瘤特異性抗原(tumorspecificantigen，TSA);另一類是在腫瘤細(xì)胞、正常組織及細(xì)胞中均存在，但在腫瘤時期含量明顯增加的腫瘤相關(guān)抗原(tumorassociatedantigen，TAA)。目前已經(jīng)有2000種以上的腫瘤抗原被鑒定。

TSA主要包括:①癌睪抗原(cancer-testisantigen，CT 抗原)［5-6］:此類抗原只在睪丸、胚胎等免疫豁免器官和腫瘤組織中表達(dá)而在其他正常組織中不表達(dá)，因此，也被認(rèn)為是腫瘤特異性共享抗原。目前已經(jīng)有超過100個基因家族的CT抗原被鑒定出來，并建立了CT抗原數(shù)據(jù)庫CTDatabase(http://www.cta.lncc.br/)，可以查閱目前為止發(fā)現(xiàn)的所有CT抗原的信息。一些針對CT抗原的治療性癌癥疫苗已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ/Ⅲ期的臨床試驗(yàn)，包括MAGE-A3和NY-ESO-1等，它們是腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)［7］。②基因突變產(chǎn)生的抗原:此類抗原也是一類潛在的腫瘤抗原，在患者和動物模型中這些突變都可能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對腫瘤的特異性CTL，啟動免疫應(yīng)答。比如突變的 p53［8］、p21/ras和 β-catenin 等，以p53為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。③病毒基因編碼的抗原:人類一些惡性腫瘤與某些特定的病毒感染疾病相關(guān)，如人乳頭瘤病毒(HPV)［8］和乙型肝炎病毒(HBV)等。此類抗原在相關(guān)的腫瘤組織中表達(dá)，可以作為預(yù)防型和治療型疫苗的理想靶點(diǎn)。④剪切不同產(chǎn)生的抗原:如何杰金淋巴瘤組織中的 restin［9］。

大多數(shù)TAA只是表現(xiàn)在表達(dá)量的變化，沒有嚴(yán)格的腫瘤特異性，最為常見的是過表達(dá)抗原。研究較多的有MelanA和HER-2/neu等［10］。

過去尋找腫瘤抗原最常用的是免疫學(xué)方法，如T細(xì)胞表位克隆技術(shù)和cDNA表達(dá)文庫的血清學(xué)分析方法(SEREX)［11］。近幾年發(fā)展起來了一些高通量的基因表達(dá)分析方法使得發(fā)現(xiàn)新腫瘤抗原的速度大大加快，如cDNA芯片分析、基因表達(dá)連續(xù)性分析和大規(guī)模平行信號測序等方法。

2 表位預(yù)測

腫瘤特異性免疫治療的前提是尋找有效的CTL表位，而CTL表位的快速篩選和鑒定又是CTL表位疫苗研究的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的表位鑒定方法如利用酸性條件從腫瘤細(xì)胞表面洗脫和鑒定抗原肽及合成大量的重疊肽，然后進(jìn)行表位鑒定，這些方法既費(fèi)時又費(fèi)力。自從基于“反向免疫學(xué)”理論的免疫信息學(xué)表位預(yù)測方法出現(xiàn)之后，對抗原表位進(jìn)行預(yù)測成為表位鑒定的有效工具［12］，通過表位預(yù)測不僅能提高表位鑒定的效率，還能夠減少合成和活性實(shí)驗(yàn)的工作量，節(jié)約研究經(jīng)費(fèi)。

當(dāng)前CTL表位預(yù)測方法的發(fā)展很快，已經(jīng)不僅僅局限于單純的MHC分子和抗原肽親和力的預(yù)測，很多軟件也加入了蛋白酶體裂解位點(diǎn)預(yù)測、TAP轉(zhuǎn)運(yùn)效率預(yù)測和抗原肽空間結(jié)構(gòu)預(yù)測等手段，且綜合運(yùn)用多種預(yù)測方法大大提高了預(yù)測的準(zhǔn)確度。目前運(yùn)用最多的預(yù)測軟件有NetCTL軟件、SYFPEITHI軟件、BIMAS預(yù)測軟件、IEDB預(yù)測軟件和EpiJen軟件等［13］。人們已經(jīng)運(yùn)用這些軟件篩選鑒定了多種有作用的抗原表位。

近年來人們綜合運(yùn)用矩陣打分、支持向量機(jī)(SVM)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)等方法將表位預(yù)測的準(zhǔn)確度進(jìn)一步提高。相信隨著蛋白質(zhì)預(yù)測技術(shù)的不斷創(chuàng)新，對CTL表位預(yù)測的準(zhǔn)確度將大大提高。

3 表位鑒定

對抗原表位的預(yù)測能夠?qū)崿F(xiàn)對表位的初步篩選，然而，目前大多數(shù)軟件的預(yù)測準(zhǔn)確率不高，因此，對表位的鑒定必須依賴后續(xù)的一系列實(shí)驗(yàn)。通常包括以下步驟:①合成預(yù)測獲得的表位肽，通過高效液相色譜(HPLC)或其他手段對表位肽進(jìn)行分析純化，通過質(zhì)譜等手段對表位肽進(jìn)行物化性質(zhì)鑒定。②通過親和力實(shí)驗(yàn)檢測表位肽與MHC分子的親和力及形成的MHC/肽復(fù)合物的穩(wěn)定性［14］，篩選得到親和力以及穩(wěn)定性較高的表位直接進(jìn)行后續(xù)的活性研究，對親和力和(或)穩(wěn)定性較低的表位可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造獲得表位肽類似物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)［15-16］。③檢測待測表位在健康志愿者和腫瘤患者的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL的能力［17］，通常進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗(yàn)或者采用細(xì)胞內(nèi)染色的方法檢測CTL分泌細(xì)胞因子的能力，通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(如Cr51或LDH釋放實(shí)驗(yàn))檢測誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL對腫瘤細(xì)胞的殺傷狀況。④檢測待測表位體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL的能力以及獲得的CTL對腫瘤細(xì)胞的殺傷狀況。通常采用HHD轉(zhuǎn)基因小鼠［18］或HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠模型［19］進(jìn)行研究。⑤建立荷瘤模型［20］，檢測體內(nèi)外誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL對實(shí)體瘤的殺傷作用。通常會建立預(yù)防型腫瘤模型和治療型腫瘤模型來研究抗原表位的作用。目前作者的研究組［21-22］也已經(jīng)通過以上方案鑒定出一些具有明顯抗腫瘤活性的抗原表位。

4 腫瘤抗原肽疫苗的研究進(jìn)展

從1990年發(fā)現(xiàn)第一個TAA開始，抗原肽疫苗的概念就為癌癥治療提供了理想的模式，旨在誘導(dǎo)獲得治療性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的合成肽疫苗經(jīng)歷了很長時間的狂熱階段，人們在抗原肽疫苗的設(shè)計、合成和轉(zhuǎn)運(yùn)方面做了很多的改進(jìn)，也鑒定獲得了相當(dāng)數(shù)量的抗原肽疫苗。目前已經(jīng)有多種抗原肽疫苗進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，如來自于 HER-2/neu、MAGE-A3、MART-1、TRP-2、gp100 和 NY-ESO-1 等抗原的單個或混合表位肽疫苗均有較多的研究［23］。

盡管抗原肽疫苗在動物模型中取得了很好的效果，但是在臨床上獲得的效果卻極其有限［24］。因?yàn)槟[瘤抗原是自身抗原，會對機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生耐受，因此自身抗原的免疫原性通常較低，所以就需要改善腫瘤抗原的免疫原性。目前常用的方法有:①改變抗原肽錨定位點(diǎn)的氨基酸殘基來增強(qiáng)它們與MHC分子的親和力，同樣也能在不產(chǎn)生自身免疫的情況下增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，已經(jīng)在一些動物模型［15］中得到了驗(yàn)證。②對MHC錨定位點(diǎn)以外的與TCR接觸位點(diǎn)的氨基酸殘基進(jìn)行不規(guī)則的替換，所產(chǎn)生的表位能夠更有效地刺激T細(xì)胞的活化，而且它們能夠打破免疫耐受。③引入非天然氨基酸來改善與MHC的結(jié)合和對TCR的激活特性，增強(qiáng)體內(nèi)作用的半衰期。④將表位肽環(huán)化來降低被蛋白酶降解的幾率，延長半衰期和穩(wěn)定性，改變構(gòu)象增加與受體的結(jié)合和改善免疫活性。⑤延長表位肽疫苗的氨基酸序列，獲得可能同時包含CTL表位和Th表位，或包含多個CTL表位的長肽［25］，不僅能夠提高免疫原性，也能夠提升免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。⑥通過分枝多肽的方法構(gòu)建獲得來源于一個或多個腫瘤抗原的小的CTL表位或Th表位的多表位疫苗［26］。

在誘導(dǎo)免疫的過程中，T細(xì)胞產(chǎn)生耐受的另外一方面是缺乏共刺激信號或危險信號。借助共刺激信號的幫助且刺激得當(dāng)?shù)脑?，APC尤其是樹突狀細(xì)胞(DC)能夠被成功地激活，擴(kuò)增并引導(dǎo)T細(xì)胞向腫瘤部位遷移。佐劑是一類能夠增強(qiáng)抗原免疫原性的物質(zhì)，目前已經(jīng)在癌癥疫苗中得到了應(yīng)用，很多佐劑除了能夠增強(qiáng)免疫刺激以外，也可以以“油包水”的狀態(tài)作為疫苗的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)起作用。目前，一些新型的佐劑主要集中在增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)以及對模式識別受體和共刺激分子等的調(diào)節(jié)方面。此外，為了增加抗原肽疫苗在臨床上成功的機(jī)會，精確地選擇治療的模式和時間點(diǎn)非常重要。

5 展望

盡管人們通過多種方法來改善腫瘤抗原肽疫苗的效果，但是到目前為止它們在臨床患者中的抗腫瘤療效還是比較有限的，通過對臨床試驗(yàn)結(jié)果的分析，今后有可能在以下方面進(jìn)行進(jìn)一步的研究和改進(jìn):①鑒定那些參與腫瘤細(xì)胞增殖/存活的腫瘤抗原以及腫瘤干細(xì)胞中表達(dá)的腫瘤抗原，以它們?yōu)榘悬c(diǎn)有可能對抗腫瘤細(xì)胞的抗原下調(diào)和清除其中的腫瘤干細(xì)胞。②鑒定發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤類型中均具有較高表達(dá)水平和抗原性的腫瘤抗原來誘導(dǎo)針對多種內(nèi)源性腫瘤抗原的免疫反應(yīng)。③改善APC對抗原加工和提呈的能力，包括使用佐劑。④通過多表位疫苗的構(gòu)建，改善CTL和Th在體內(nèi)擴(kuò)增的能力。⑤了解癌癥產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)的機(jī)制，打破機(jī)體對腫瘤的免疫耐受狀態(tài)，尤其是針對腫瘤微環(huán)境中的一些抑瘤信號途徑、細(xì)胞因子和負(fù)性共刺激分子為靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤免疫治療。⑥在治療的時機(jī)上，更好地與放化療進(jìn)行配合。此外，以預(yù)防為主的腫瘤抗原肽疫苗在誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)中是極其有效的，可能具有更好的應(yīng)用前景。隨著抗原肽疫苗的不斷改進(jìn)，它必將會成為治療腫瘤的一種重要手段。

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