張曉娟,王廣策,何林文,陳昌生

(1.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所,山東 青島 266071;2.中國(guó)科學(xué)院 研究生院,北京 100049;3.天津科技大學(xué)海洋學(xué)院,天津 100039;4.集美大學(xué) 漁業(yè)學(xué)院,福建 廈門(mén)361020)

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC;EC 4.1.1.31)在二價(jià)金屬離子Mg2+或 Mn2+存在下,能夠催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與反應(yīng)生成草酰乙酸(OAA)這一不可逆反應(yīng)[1]：。該酶廣泛分布在高等植物、藻類(lèi)、藍(lán)細(xì)菌、細(xì)菌、原生生物中,在動(dòng)物和真菌中尚未發(fā)現(xiàn)[2-4]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶存在于所有的光合生物中,是光合作用中的關(guān)鍵酶,主要功能是為三羧酸循環(huán)補(bǔ)充四碳酸,在 C4植物和景天科植物光合代謝途徑中扮演著濃縮固定 CO2[4-5]。此外該酶還參與氨基酸代謝中碳骨架的回補(bǔ)、參與種子形成與萌發(fā)、果實(shí)成熟、植物保衛(wèi)細(xì)胞氣孔開(kāi)閉、豆科植物根瘤固氮過(guò)程、維持離子和pH值平衡等諸多作用[6-10]。

在種族和系統(tǒng)演生進(jìn)化過(guò)程的研究中,分子特征已經(jīng)成為一種重要工具。近年來(lái),PEP羧化酶的全氨基酸序列和全核苷酸序列甚至全序列的一部分能夠作為分子遺傳標(biāo)記已為諸多研究者所報(bào)道[3,6,11-14],PEP羧化酶的序列特征能夠在生物體和代謝途徑之間建立系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

壇紫菜是我國(guó)南方特有的深受亞洲人民歡迎的經(jīng)濟(jì)紅藻,也是我國(guó)出口創(chuàng)匯的主要農(nóng)產(chǎn)品之一。它屬于原紅藻綱(Protoflorideae)、紅毛菜目(Bangiales),是一種原始紅藻,具有特殊的生活史和世代交替現(xiàn)象,包含葉狀體(單倍配子體)和絲狀體(二倍孢子體),葉狀體在冬春季生長(zhǎng)旺盛,主要分布于潮間帶礁石上。絲狀體渡夏,而且鉆入貝殼等碳酸鈣基質(zhì)中生長(zhǎng),主要分布于潮下帶,是一種石內(nèi)生藻類(lèi)(endolithic algae)。壇紫菜pH值補(bǔ)償機(jī)制高,具有低的Km值,能利用作為光合作用時(shí)的碳源,其低的無(wú)機(jī)碳補(bǔ)償點(diǎn)表明壇紫菜具有濃縮碳的作用[15-16]。本實(shí)驗(yàn)室的 Fan等[17]構(gòu)建了壇紫菜絲狀體(孢子體)的11000條EST,同時(shí)在壇紫菜代謝途徑分析中,主要分析了無(wú)機(jī)碳的固定途徑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)壇紫菜絲狀體階段可能存在類(lèi)C4的固碳途徑。本實(shí)驗(yàn)克隆了壇紫菜 PEP羧化酶基因的部分序列,對(duì)其做了系統(tǒng)進(jìn)化分析,對(duì)進(jìn)一步深入研究壇紫菜光合作用、碳代謝等具有重要的參考價(jià)值,同時(shí)為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 壇紫菜絲狀體的獲得

試驗(yàn)中所用的壇紫菜絲狀體為本實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所藻類(lèi)分子生理與發(fā)育調(diào)控實(shí)驗(yàn)室)保留藻株,培養(yǎng)基為海水加富培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為18℃,光強(qiáng)約為 1 800 lux,光：暗周期為 12 ：12,通入過(guò)濾法消毒后的空氣進(jìn)行培養(yǎng),每周更換 1次培養(yǎng)基。用蒸餾水沖洗干凈后進(jìn)行提取RNA。

1.2 試劑、試劑盒及儀器

總RNA提取采用天根生物公司的RNAprep pure試劑盒,cDNA合成采用Superscript ΙΙ? 反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Invitrogen公司,USA)。 PCR擴(kuò)增目的基因片段、DNA純化、連接所用試劑盒和載體為pMD-18T購(gòu)自東盛生物公司和TaKaRa生物技術(shù)有限公司,菌株為E.coliTop 10。藥品均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。序列測(cè)定委托上海生工生物技術(shù)公司完成。

1.3 壇紫菜PCPC同源序列的克隆

EST 的釣取及組裝：從 http：//est.kazusa.or.jp/en/plant/porphyra/EST/上獲得了與條斑紫菜PEP羧化酶相關(guān)的 EST 序列：AU193218、AU193318、AU191558、AU188467、AV430322、AU195387、AU195597、AU192608、AU196318、AU191989、AU191907、AU195415、AU191278、AU192140、AU192294、AU196648、AU191070、AU190685、AV430724、AU192096、AU192037、AV431839、AU194305、AV433323、AU188200[18-19]。利用BioEdit生物學(xué)軟件對(duì)這些 EST序列進(jìn)行拼接,從中設(shè)計(jì) PEPCS1(5′-CTCCAGCATGTCGAATGTAGCG-3′)和 PEPCA1(5′-CCGTCGTGTACGTCTCAAGGGT-3′)一 對(duì) 引 物 ,以壇紫菜的cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR儀器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司。

PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5min;94℃變性30s,60°C退火 30s,72℃延伸 2min,30個(gè)循環(huán);72°C延伸10min;4°C保存。

反應(yīng)體系見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),目的條帶用瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化(購(gòu)自北京天根生物公司)后克隆入 pMD18-T載體(TaKaRa),轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 Top 10感受態(tài)細(xì)胞中,轉(zhuǎn)化后,于氨芐LB培養(yǎng)基上挑取單克隆培養(yǎng),用上述引物再次進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,以進(jìn)一步驗(yàn)證克隆為陽(yáng)性,將陽(yáng)性克隆送去上海生工生物技術(shù)公司采用ABI3730自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。

表1 PCR擴(kuò)增體系Tab.1 PCR amplification system

1.4 RACE PCR克隆PEPC的3′末端

以接頭引物 AdapterdT(5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC 1qzT17-3′)引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄合成。用通用引物up(5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′) 和 基 于PEPC部分序列設(shè)計(jì)的基因特異引物 E31(5′-GCCGCCCAAGACTATCAATG-3′)和 E32(5′-TCTACCGCTTCGTACACCCACT-3′),采用半巢式 PCR 的方法(semi-nested PCR)擴(kuò)增基因3′末端。應(yīng)用Touch down的PCR程序：25μL體系(同表1);94℃預(yù)變性5min;94℃變性 30s,66℃退火 30s(每一循環(huán)降低 0.6℃),72℃延伸1min,10個(gè)循環(huán);94℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min,25個(gè)循環(huán);72°C延伸10min;4°C保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),目的條帶用瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化(購(gòu)自北京天根生物公司)后克隆入 pMD18-T載體(TaKaRa,大連寶生物公司),轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top 10感受態(tài)細(xì)胞中,轉(zhuǎn)化后,于氨芐 LB培養(yǎng)基上挑取單克隆培養(yǎng), 用上述引物再次進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,以進(jìn)一步驗(yàn)證克隆為陽(yáng)性,將陽(yáng)性克隆送去測(cè)序。

1.5 序列分析

序列同源性對(duì)比采用 NCBI中的 BLAST軟件(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行;氨基酸序列分析采用 ExPASy在線工具(http：//www.expasy.org/);結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)采用Pfam HMM軟件(http：//pfam.sanger.ac.uk/search);信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用 SignalP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/signalP/);TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)用于尋找跨膜結(jié)構(gòu);根據(jù)PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)壇紫菜PEP羧化酶氨基酸序列進(jìn)行活性位點(diǎn)的分析。重建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)所用的PEP羧化酶核苷酸序列通過(guò)對(duì)GenBank的BLAST檢索獲得。重建PEP羧化酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)時(shí),選取了16個(gè)有代表性的序列(來(lái)自不同類(lèi)群,如表2所示)。

2 結(jié)果與討論

2.1 序列分析

所克隆的序列長(zhǎng)為 2 538 bp,與原從條斑紫菜EST數(shù)據(jù)庫(kù)中拼接出的 PEPC序列片段相似性高達(dá)89.5%。該片段是一個(gè)連續(xù)的讀碼框,在閱讀框中不存在起始密碼子,但還有一個(gè) TAG終止密碼子,191bp的 3′端非編碼區(qū)(UTR)和 ploy A 尾巴,編碼846個(gè)氨基酸。3′端非編碼區(qū)(UTR)沒(méi)有找到傳統(tǒng)的AAUAAA的加尾信號(hào),這在其他紅藻中也很少有發(fā)現(xiàn),如Porphyra yezoensis的β-tubulin基因和carbonic anhydrase基因[20-21],以及Gracilaria gracilis的galactose1-phosphate uridyl transferase 基因[22]。

BLASTx檢索發(fā)現(xiàn)所有的同源序列均為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC),且同源性很高。以Blast軟件對(duì)壇紫菜PEPC基因氨基酸序列的相似性比對(duì)結(jié)果表明,PEPC 與被子植物,裸子植物,藻類(lèi)和細(xì)菌均有一定的一致性,如與玉米(Zea mays)為 46%,與蘆薈(Aloe arborescens)為 46%,與水稻(Oryza sativa Japonica Group)為47%,與大腸桿菌的(Escherichia coli)為 35%,一致性范圍在 35%～50%之間,由于 C4型的 PEPC的 C末端第774位或附近的一個(gè)氨基酸均為絲氨酸(S),而所有C3或CAM型的PEPC相應(yīng)位置均為丙氨酸(A)[1,4,23-24],本研究中的PEPC在相對(duì)應(yīng)位置為丙氨酸(A),所以不可能是一個(gè)C4型的PEPC(圖1)。

表2 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)所用序列Tab.2 PEPC isoforms used for phylogenetic analysis

圖1 部分C3,C4植物PEPC氨基酸部分序列的比較Fig.1 Partial sequence alignment of amino acid residues of PEPC from some C3 and C4 plants

Pfam HMM 軟件分析顯示氨基酸序列中的第130至第841個(gè)氨基酸之間為PEP羧化酶的結(jié)構(gòu)域;信號(hào)肽預(yù)測(cè)SignalP和TMHMM在線軟件分析顯示該段序列既沒(méi)有信號(hào)肽序列,也沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)。

圖2 壇紫菜PEPC核苷酸及氨基酸序列Fig.2 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of PEPC from Porphyra haitanensis

根據(jù)PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)分析,其氨基酸序列含有兩個(gè)大的 PEP羧化酶活性位點(diǎn),分別為 PS00781(VLTAHPTQAVRR)和PS00393(VMVGYSDSGKDGG),另外還含有4種模式的其他功能位點(diǎn),分別為：依賴(lài)于 cAMP和 cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(cAMP-and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site,PS00004),蛋白激酶 C磷酸化位點(diǎn)(Protein kinase C phosphorylation site,PS00005),酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(Casein kinase II phosphorylation site,PS00006)和 N-端十四烷酰化位點(diǎn)(N-myristoylation site,PS00008)。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

多序列比對(duì)采用 Clustal X 程序,采用 Clustal X 程序和MEGA 4.0 軟件,以臨位相聯(lián)法(Neighbor-Joining)法來(lái)重建,計(jì)算方法重復(fù)1 000次,進(jìn)化距離選擇 p距離(p-distance),空缺或者缺失(gaps/missing data)的處理采用完全刪除(complete deletion),以此構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖3所示。

圖3 采用N-J 法以Clustal X和MRGA4.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(計(jì)算重復(fù)1000次)Fig.3 Phylogenetic analysis of 17 PEPC isoforms.In this Neighbor-joining consensus tree,numbers on internal branches are percent bootstrap values of 1000 replicates

對(duì) PEP羧化酶進(jìn)行進(jìn)化分析,同時(shí)選取了裸子植物、被子植物、藻類(lèi)及微生物中的16個(gè)序列,結(jié)果如圖2所示。壇紫菜PEPC羧化酶氨基酸序列以及綠藻中的萊因衣藻(C.reinhardtii)和綠藻(Micromonassp.),都不和其他的聚類(lèi)。種子植物和裸子植物中的C3型的PEPC及CAM型的PEPC聚為一個(gè)大的進(jìn)化支,雖然種子植物和裸子植物中的 C4型的PEPC各聚為一支,但他們的進(jìn)化距離相當(dāng)。大腸桿菌與硅藻(Phaeodactylum tricornutum和Thalassiosira pseudonana)聚為同一支,是與他們之間的進(jìn)化關(guān)系密切相連的,硅藻中有數(shù)百個(gè)基因是來(lái)自于細(xì)菌的[25],所以他們都可以歸為細(xì)菌型的 PEP羧化酶。本系統(tǒng)進(jìn)化圖與 Gehrig等[13-14]1998年和 2001年構(gòu)建的PEP羧化酶部分氨基酸序列基本上是一致的。

如前人所述, PEP羧化酶可以分為四種類(lèi)型：C3型、C4型,CAM型及細(xì)菌型,C3亞型最先出現(xiàn),C4和CAM亞型被認(rèn)為是由C3亞型進(jìn)化而來(lái),而且二者分別多次獨(dú)立起源[1,6,26],本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖很好的詮釋了PEPC的代謝途徑與進(jìn)化關(guān)系。

在本圖中,從大的分支上來(lái)說(shuō),壇紫菜 PEP羧化酶氨基酸序列是與綠色植物聚在一支的,是完全有別于細(xì)菌類(lèi)型的 PEP羧化酶的一支,從進(jìn)化上來(lái)看,壇紫菜PEP羧化酶氨基酸序列更接近于C3型(這在之前的序列分析中也有所體現(xiàn)),進(jìn)化上更為古老。紅藻最初依據(jù)林曼系統(tǒng)分類(lèi)法歸為植物,但后來(lái)歸為最古老的真核生物,關(guān)于紅藻的進(jìn)化和起源一直是困擾科學(xué)家的一個(gè)問(wèn)題。本進(jìn)化圖中壇紫菜PEP羧化酶氨基酸序列的進(jìn)化可能也與紅藻特殊的進(jìn)化地位有關(guān)系。

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