杜銀香

湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院(湖北 恩施 445000)

霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察是微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)的一個(gè)重要內(nèi)容，也是對(duì)霉菌進(jìn)行分類鑒別的重要依據(jù)之一。觀察霉菌形態(tài)的方法主要有直接制片觀察法、載玻片培養(yǎng)觀察法和玻璃紙培養(yǎng)觀察法[1]。以往我們觀察標(biāo)本時(shí)多采用直接制片觀察法中的水浸片，因?yàn)橛幸后w的存在，故標(biāo)本片保存的時(shí)間有限。我們?cè)陂L(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中發(fā)現(xiàn)了一種簡(jiǎn)便的、可以長(zhǎng)時(shí)間保存的、也很容易大批量制作霉菌標(biāo)本片的方法，特介紹如下。

1 材料與方法

1.1材料(1)菌種：總狀毛霉(來源于腐乳中，經(jīng)分離鑒定為總狀毛霉)。 (2)培養(yǎng)基：沙氏瓊脂(生產(chǎn)批號(hào)20100520 杭州微生物試劑有限公司)。(3)儀器設(shè)備及其他：生物安全柜(Ⅱ級(jí)AC2-4S1 ESCO公司生產(chǎn)) ，恒溫恒濕培養(yǎng)箱(型號(hào)XMT-9017重慶永恒實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn))，普通光學(xué)顯微鏡(型號(hào)BM1000 南京江南永新光學(xué)有限公司生產(chǎn))，加拿大樹膠、載玻片、蓋玻片、眼科鑷、解剖針等 。

1.2 方法

(1)玻片的清洗：新的載玻片、蓋玻片因含游離堿，應(yīng)先在1%鹽酸溶液中浸泡24 h后，再用自來水沖洗干凈，晾干后使用。

(2)結(jié)晶紫染液的配制：先稱取結(jié)晶紫4～8 g，溶于95%乙醇100 mL中，制成結(jié)晶紫飽和液，再取此飽和液20 mL與1%草酸銨溶液80 mL混合，過濾后使用。

(3)菌種的準(zhǔn)備：在生物安全柜內(nèi)，利用孢子很容易飛散的特點(diǎn)，直接將長(zhǎng)有總狀毛霉的平板倒扣在需要接種的沙氏瓊脂平板上，輕輕地敲擊幾下菌種平板，使孢子落到下面的平板上，放入溫度25℃、濕度80%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后取出，看到氣生菌絲呈白色，長(zhǎng)約10 mm左右即可。

( 4)制片:在載玻片上1/3與2/3交界處滴加一滴生理鹽水后，再用滅菌冷卻后的眼科鑷夾取突出在培養(yǎng)基表面的菌絲少許，輕輕地放入生理鹽水中，用解剖針將菌絲分散開后，放空氣中自然干燥或置25℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱使其干燥。

(5)染色:采用單染法，用結(jié)晶紫染液染色1 min后，水洗，灑去載玻片上多余的水份后，讓其自然干燥或置25℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱使其干燥，待完全干燥后，蓋上蓋玻片，四周用加拿大樹膠封片。

1.3結(jié)果在普通光學(xué)顯微鏡下可見孢囊梗及孢子囊、孢子囊孢子均成紫色。孢囊梗無橫隔膜，最初不分枝，以后分枝，分枝長(zhǎng)短不一，各分枝頂端均有孢子囊。 孢子囊呈球形，嫩孢子囊較小，染色較淺，成熟孢子囊較大，染色較深，還可見有些成熟孢子囊孢囊壁已經(jīng)消解。孢子囊孢子呈卵形，表面光滑。

2 體會(huì)

2.1菌種準(zhǔn)備時(shí)注意事項(xiàng)

(1)培養(yǎng)的溫度：溫度會(huì)影響菌絲的生長(zhǎng)和代謝。在實(shí)踐中我們發(fā)現(xiàn)如果取氣生菌絲制作霉菌標(biāo)本片，一般溫度在25℃比較合適，在這個(gè)溫度下培養(yǎng)48 h左右的氣生菌絲較長(zhǎng)，容易取材，并且孢子囊孢子的成熟度也不高。如溫度過低，則菌絲生長(zhǎng)太過緩慢，整個(gè)制作過程花費(fèi)時(shí)間會(huì)太長(zhǎng)。如溫度過高，則菌絲會(huì)很快老化、死亡，產(chǎn)生的孢子囊孢子很快就會(huì)成熟破裂，大量孢子會(huì)釋放出來，且附著在菌絲上，影響菌絲結(jié)構(gòu)的觀察。

(2)培養(yǎng)基的選擇:我們?cè)趯?shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),如果用培養(yǎng)細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂去培養(yǎng)總狀毛霉，總狀毛霉的氣生菌絲始終只有1～2 mm，不會(huì)太長(zhǎng)，不適合取標(biāo)本。營(yíng)養(yǎng)瓊脂和沙氏瓊脂主要區(qū)別在于培養(yǎng)基的pH值不一樣，前者pH為7.4左右，而后者的pH為6.0左右，pH也是影響菌絲的生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素，因此我們一般用沙氏瓊脂來培養(yǎng)總狀毛霉。

(3)氧氣：總狀毛霉在氧氣充足的情況下氣生菌絲生長(zhǎng)良好。我們一般用沙氏瓊脂平板來培養(yǎng)總狀毛霉，并且培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)皿正立，培養(yǎng)皿的蓋與底部之間留一絲縫隙，讓其生長(zhǎng)時(shí)氧氣充足。

2.2制片注意要點(diǎn)

(1)盡量取呈白色的氣生菌絲，不可用有黑點(diǎn)太多的菌絲，黑點(diǎn)太多，則說明產(chǎn)生的孢子囊孢子大多已經(jīng)快成熟了，稍一接觸菌絲，這些孢子囊會(huì)破裂。

(2)取菌絲時(shí)盡量取長(zhǎng)一點(diǎn)，從接近培養(yǎng)基基質(zhì)的地方開始取，菌絲不可取得太多，取得太多的話，菌絲很容易糾纏在一起，不容易分散開。

(3)菌絲放入到生理鹽水中后就盡量不要去攪動(dòng)它，否則大量的孢子囊也會(huì)破裂。

(4)載玻片上的生理鹽水放得稍稍多一點(diǎn)，這樣菌絲也就很容易浮在生理鹽水的表面，菌絲自然就分散開了。

(5)制片時(shí)不能加熱固定，加熱后菌絲和孢子都會(huì)變形。

2.3染料的選擇染色時(shí)我們嘗試用細(xì)菌染色時(shí)常用的染料結(jié)晶紫和石炭酸復(fù)紅分別進(jìn)行單染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用石炭酸復(fù)紅單染后菌絲和孢子都著色，但菌絲細(xì)胞收縮變形了，原因不明，有待進(jìn)一步研究。用結(jié)晶紫單染的菌絲和孢子都著色，形態(tài)和用乳酸酚棉藍(lán)染色后的效果沒有區(qū)別，因此我們選擇了用結(jié)晶紫染液。

2.4其他注意事項(xiàng)染色后水洗時(shí)一定注意不可直接打開水龍頭沖洗，否則很容易將玻片上的菌絲及孢子沖掉。我們是將玻片輕輕地放入裝有水的容器中，讓水把紫色的染料慢慢地褪掉，看到?jīng)]有紫色褪下即可；結(jié)晶紫染液配置好后一定要過濾，否則雜質(zhì)易沾到標(biāo)本片上，影響霉菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察；標(biāo)本片的制備過程中需要注意生物安全，接種和制片時(shí)都需要在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

[1] 曾松榮.細(xì)菌、霉菌玻片標(biāo)本的制作技巧[J].生物學(xué)通報(bào),2004,39(4)：52.