何德才,艾儒棣

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肛腸科,四川南充 637000;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)外科教研室,四川成都 610075)

復(fù)方芪竭膏是按成都中醫(yī)藥大學(xué)艾儒棣教授的經(jīng)驗(yàn)方制備而成,經(jīng)數(shù)十年的臨床應(yīng)用,均顯示出良好的消炎、止痛、促進(jìn)瘡瘍愈合的功效,為進(jìn)一步探討復(fù)方芪竭膏的促愈效應(yīng)及其可能的作用機(jī)理。我們進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 藥物來(lái)源與制劑加工:復(fù)方芪竭膏:由中藥黃芪 50g、血竭 50g、紫草 10g、當(dāng)歸 20g、白芷 20g、冰片10g、麻油 500g按傳統(tǒng)工藝制備成油膏制劑。京萬(wàn)紅軟膏(JWH)由天津達(dá)仁堂京萬(wàn)紅藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào):Z12020440。

1.2 受試藥物復(fù)方芪竭膏(CQJC)制備:將方中血竭、冰片取出研成細(xì)粉,過(guò) 100目篩,備用。將方中余藥黃芪、血竭、紫草、當(dāng)歸、白芷、甘草等浸入麻油中浸泡 72小時(shí),將油及藥入鐵鍋內(nèi),文火使藥料炸至表面呈深褐色,中部焦黃為度,濾去藥渣,待溫度降至適宜時(shí),將冰片細(xì)粉徐徐攪拌入藥油中,再將一定比例醫(yī)用凡士林基質(zhì)加入其中,文火徐徐收膏備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與造模方法[1,2]:選用 SD大鼠 60只,雌雄不拘。體重(220±10)g。于大鼠后背部脊柱旁開(kāi) 1cm處打孔造成直徑 1.8cm的圓形,全層皮膚切除,開(kāi)放創(chuàng)面,深達(dá)肌肉,止血。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與給藥方法:按隨機(jī)分組法,分為模型組(A組)、陽(yáng)性藥物對(duì)照組京萬(wàn)紅(B組)、治療組復(fù)方芪竭膏組(C組),每組各 6只大鼠。A組大鼠創(chuàng)面外敷凡士林 0.1g,B組大鼠創(chuàng)面外敷京萬(wàn)紅膏 0.1g,C組大鼠創(chuàng)面外敷復(fù)方芪竭膏 0.1g;均消毒紗布包扎固定。各組大鼠每日換藥 1次。

1.5 觀察項(xiàng)目與檢測(cè)方法:第 3、7、10、14天,用滌綸投影膜描計(jì)創(chuàng)面大小,用圖像分析軟件 MIAS2000予以分析,計(jì)算創(chuàng)面愈合率;分別于第 3、7、14天隨機(jī)選取各組 6只大鼠采用過(guò)量麻醉處死,剪取創(chuàng)緣交界處肉芽組織,用 S-P法測(cè)定溶菌酶(Lysozyme)的表達(dá),用 Tunel-AP法進(jìn)行原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:計(jì)量資料以 x-表示;多組間樣本均數(shù)比較用方差分析和兩兩比較 q檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSSl6.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面愈合率比較結(jié)果顯示:與模型組相比,京萬(wàn)紅組、芪竭膏組第 7、10、14天創(chuàng)面愈合率均優(yōu)于對(duì)比組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05),其中芪竭膏組有顯著性差異(p＜0.01);與京萬(wàn)紅組相比,芪竭膏組第 7、10天創(chuàng)面愈合率優(yōu)于對(duì)比組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。提示京萬(wàn)紅組、芪竭膏組均有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用,尤其在皮膚創(chuàng)面愈合的中、后期,芪竭膏組有明顯促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用,見(jiàn)表 1。

表1 各組愈合率的比較(%,x-±s,n=6)

2.2 用 S-P法測(cè)定溶菌酶(Lysozyme)的表達(dá):結(jié)果顯示:復(fù)方芪竭膏組與京萬(wàn)紅組大鼠創(chuàng)面溶菌酶含量在術(shù)后第 3、7、14天均較模型組大鼠多(p＜0.01)。術(shù)后第 3、7天復(fù)方芪竭組與模型組比較 p＜0.01;京萬(wàn)紅組與模型組比較 p＜0.01。術(shù)后第 7天,復(fù)方芪竭組大鼠創(chuàng)面溶菌酶含量達(dá)到峰值,較模型組多(p＜0.01);此時(shí)京萬(wàn)紅組大鼠創(chuàng)面溶菌酶含量少于復(fù)方芪竭組(p＜0.05)。術(shù)后第 14天,復(fù)方芪竭膏組大鼠創(chuàng)面溶菌酶含量較術(shù)后第 7天有減少趨勢(shì),但仍較模型組大鼠多(p＜0.01);復(fù)方芪竭膏組與模型組比較,p＜0.01;而此時(shí)京萬(wàn)紅組大鼠創(chuàng)面溶菌酶含量少于復(fù)方芪竭組(p＜0.05),見(jiàn)表 2。

表2 各組溶菌酶含量(x-±s)變化(IOD×103 n=6)

2.3 用 Tunel-AP法進(jìn)行原位細(xì)胞凋亡檢測(cè):結(jié)果顯示:復(fù)方芪竭膏組與京萬(wàn)紅組大鼠創(chuàng)面凋亡細(xì)胞凋亡指數(shù)在術(shù)后第 3、7天均較模型組大鼠多(p＜0.01)。術(shù)后第 3、7天復(fù)方芪竭組與模型組比較 p＜0.01;京萬(wàn)紅組與模型組比較 p＜0.01。術(shù)后第 7天,復(fù)方芪竭組大鼠創(chuàng)面凋亡細(xì)胞凋亡指數(shù)達(dá)到峰值,較模型組多(p＜0.01);此時(shí)京萬(wàn)紅組大鼠創(chuàng)面凋亡細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯少于復(fù)方芪竭組(p＜0.01)。術(shù)后第 10天,復(fù)方芪竭膏組大鼠創(chuàng)面凋亡細(xì)胞凋亡指數(shù)較術(shù)后第 7天有明顯減少,與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p﹥ 0.1);與京萬(wàn)紅組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);術(shù)后第 14天,復(fù)方芪竭膏組與模型組比較,p＜0.01;而此時(shí)京萬(wàn)紅組創(chuàng)面凋亡細(xì)胞凋亡指數(shù)較術(shù)后第 10天增多(p＜0.01),見(jiàn)表3。

表3 創(chuàng)面原位凋亡細(xì)胞凋亡指數(shù)(x-±s)(AI%)

3 討 論

創(chuàng)傷修復(fù)始終是外科領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)之一。目前對(duì)其研究已深入到細(xì)胞、分子與基因水平[1]中醫(yī)促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)理主要是針對(duì)創(chuàng)面愈合的主要影響因素發(fā)揮其多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多層次的綜合調(diào)控作用[2]。中醫(yī)認(rèn)為,創(chuàng)傷后機(jī)體氣血失調(diào)、營(yíng)衛(wèi)失和,氣血凝滯,經(jīng)絡(luò)阻塞,臟腑功能失調(diào):故活血化瘀、行氣通絡(luò)是愈創(chuàng)的關(guān)鍵。

復(fù)方芪竭膏是成都中醫(yī)藥大學(xué)艾儒棣教授根據(jù)明代陳實(shí)功的《外科正宗》生肌玉紅膏去輕粉,加黃芪化裁而成的經(jīng)驗(yàn)方,經(jīng)數(shù)十年的臨床應(yīng)用,均顯示出良好的消炎、止痛、促進(jìn)瘡瘍愈合的功效。主要由中藥黃芪、血竭、紫草、當(dāng)歸、白芷、冰片、麻油組成。方中黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、托毒生肌的功效。血竭始載于《唐本草》,其性味甘溫、咸、平,具有活血化瘀、祛腐生肌、收斂止血、消腫止通的功效,古代主要將它用于治療跌打損傷、金瘡等癥,是中醫(yī)用于生肌的最常見(jiàn)藥物。二藥共為君藥。紫草味苦寒,涼血活血,清熱解毒,當(dāng)歸活血祛瘀,能改善局部組織血液循環(huán),白芷入藥始見(jiàn)于《本草綱目》,載曰“排膿生肌止痛”。潰膿止痛而達(dá)生肌之功效。三藥共為臣藥。冰片外用具有清熱止痛、止癢生肌、燥濕收膿、促進(jìn)藥物吸收作用為佐藥。麻油具有很好的輔助療效,能酸化傷口,利于傷口肉芽組織的生長(zhǎng),為使藥。全方共奏補(bǔ)氣固表、清熱解毒、活血化瘀、升肌收口的功效。

溶菌酶通常存在于吞噬細(xì)胞胞漿的溶酶體中,是吞噬細(xì)胞吞噬并消化細(xì)菌和異物最主要的活性酶。它的含量不僅反應(yīng)吞噬細(xì)胞的活性,也能從一定程度反應(yīng)炎癥反應(yīng)程度。本實(shí)驗(yàn)采用 S-P免疫組化染色方法顯示的溶菌酶分布面積可以相對(duì)表示組織中巨噬細(xì)胞的分布范圍,即在一定程度上表示活躍的吞噬細(xì)胞的數(shù)量,而陽(yáng)性細(xì)胞胞漿 IOD均值則可以從一定程度反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞胞漿中溶菌酶的相對(duì)平均含量。而溶菌酶本身就有很好的殺菌效果,創(chuàng)面溶菌酶菌能力強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:無(wú)論從質(zhì)到量,復(fù)方芪竭膏組優(yōu)于其他各組,同時(shí)溶菌酶到達(dá)峰值時(shí)間較其它組提前,持續(xù)時(shí)間也較長(zhǎng),提高創(chuàng)面吞噬細(xì)胞溶菌酶含量意味著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性及功能,而巨噬細(xì)胞的功能的增強(qiáng),清理“廢墟”的作用必然增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中外用中藥作用的創(chuàng)傷滲出液中含有大量形態(tài)和功能活躍的巨噬細(xì)胞,可能是外用中藥“偎膿長(zhǎng)肉”的理論基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡是指外界因素和內(nèi)部因素相互作用后,通過(guò)一系列分子信號(hào)的傳導(dǎo),引發(fā)特異基因表達(dá),而最終導(dǎo)致的細(xì)胞主動(dòng)死亡。細(xì)胞凋亡與創(chuàng)面修復(fù)有密切關(guān)系,它參與調(diào)控創(chuàng)面愈合過(guò)程中的多個(gè)環(huán)節(jié)而影響預(yù)后。通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制可使炎癥過(guò)程中凋亡細(xì)胞被炎癥細(xì)胞和其它細(xì)胞有效清除,利于創(chuàng)面的愈合和減輕愈合組織中瘢痕的形成。本實(shí)驗(yàn)采用 TUNEL法檢測(cè)創(chuàng)面肉芽組織中細(xì)胞凋亡情況,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:在換藥的第 3、7d使用復(fù)方芪竭膏時(shí),創(chuàng)面凋亡細(xì)胞明顯增加,此后逐漸復(fù)至正常水平。提示復(fù)方芪竭膏具有明顯促進(jìn)局部組織細(xì)胞亡的作用。復(fù)方芪竭膏誘導(dǎo)細(xì)胞的主動(dòng)凋亡,特別是誘導(dǎo)位于創(chuàng)面壞死組織與正常組織之間過(guò)渡區(qū)域的“垂死細(xì)胞”的凋亡,利于促進(jìn)壞死組織的脫落,有利于創(chuàng)傷早期,創(chuàng)面的清創(chuàng)作用。[3]

本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明外用中藥復(fù)方芪竭膏能促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合,其可能機(jī)制是復(fù)方芪竭膏能提高創(chuàng)面吞噬細(xì)胞溶菌酶含量、誘導(dǎo)細(xì)胞的主動(dòng)凋亡有利于創(chuàng)傷早期創(chuàng)面的清創(chuàng)作用。其促愈的分子機(jī)制有待更深入研究。

[1] 付小兵,程 飚,盛志勇.生長(zhǎng)因子應(yīng)用于臨床創(chuàng)傷修復(fù):十年的主要進(jìn)展與展望[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志,2004,18(6):508

[2] 邢 捷,闕華發(fā),唐漢鈞.中醫(yī)藥促進(jìn)皮膚潰瘍創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究近況[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2008,6(10):1080

[3] 袁 亮,李國(guó)棟.中醫(yī)祛腐生肌法祛腐作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,30(2):45-47