喻 卓，陳 鵬，段 理，何 波，沈志強(qiáng)*

(1昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，昆明650032;2昆明醫(yī)學(xué)院)

血小板活化后可結(jié)合中性粒細(xì)胞，并激活所結(jié)合的中性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞活化后分泌的某些細(xì)胞因子，進(jìn)一步活化血小板［1，2］。因此，血小板—中性粒細(xì)胞的相互作用，在血栓形成及炎癥過程中起著重要作用，阻抑血小板—中性粒細(xì)胞之間相互作用的藥物將更有利于血栓栓塞性疾病的防治。松胞菌素D來源于肉球菌，我們在進(jìn)行抗血小板藥物篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)地抑制血小板聚集作用。2009年3月～2010年8月，我們在此基礎(chǔ)上探討了松胞菌素D在體內(nèi)外的抗血小板作用，并進(jìn)一步觀察其對血小板與中性粒細(xì)胞之間相互作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康家兔，體質(zhì)量1.8～2.2 kg，雌雄均用，由昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑與儀器 松胞菌素D由中科院昆明植物研究所劉吉開研究員提供，用前溶于0.9%生理鹽水中(pH約7.0)?；ㄉ南┧?AA)、血小板活化因子(PAF)系Sigma公司產(chǎn)品，AA臨用前溶于100 mmol/L Na2CO3溶液中，PAF用含0.25%小牛血清蛋白(BAS)的Tris-NaCl緩沖溶液稀釋。腺苷二磷酸(ADP)系由Fluka化學(xué)公司提供，用前溶于生理鹽水中。淋巴分離液(比重1.077)購自上海華精生物高科技有限公司。Hanks液(mmol/L，pH 7.4):NaCl 137，KCl 5，CaCl21.3，MgSO40.7，H2O 0.8，Na2HPO40.6，KH2PO40.4，NaHCO33.0，葡萄糖5.6，用前新配。LBY-NJ血液凝集儀，由北京普利生精密儀器研究中心(北京普利生科貿(mào)集團(tuán))提供;臺式冷凍離心機(jī)(centra-MP4R)，由INTERNATIONAL EQUIPMENT COMPANY提供;THZ-C恒溫振蕩器，由江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠提供;Olympus像差顯微鏡屬日本生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 富血小板血漿(PRP)與洗滌血小板的制備自清醒家兔頸總動(dòng)脈取血，以3.8%枸櫞酸鈉(做聚集試驗(yàn))或2.7%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(做黏附試驗(yàn))抗凝收集于塑料離心管中，血與抗凝劑體積比為9∶1，室溫900 r/min離心8min得PRP，剩余血液繼以3 000 r/min離心10min得貧血小板血漿(PPP)，上述PRP以3 000 r/min離心10min得血小板團(tuán)塊，用含1%BSA及1.4%EDTA的磷酸緩沖液(PBS)洗滌血小板3次，最后懸浮于上述PBS液中，調(diào)血小板數(shù)至1×108cell/ml左右，用臺盼蘭排斥試驗(yàn)證實(shí)其成活率＞95%。

1.3.2 中性粒細(xì)胞的制備 吸出PRP后，在上述剩余的抗凝血中加入與PRP等體積的生理鹽水，再加入1/6體積的右旋糖酐混勻，于37℃靜置30min以沉淀紅細(xì)胞，將上層白細(xì)胞吸出后平鋪于3ml淋巴細(xì)胞分離液上，2 000 r/min離心30min，棄上清，加入1ml雙蒸水溶血30 s，使混雜的紅細(xì)胞破膜，再加入2倍濃度的PBS 1ml混勻，使中性粒細(xì)胞恢復(fù)等滲狀態(tài)，以800 r/min離心10min，中性粒細(xì)胞團(tuán)塊用PBS洗3次，最后懸浮于Hanks液中，并分別記數(shù)為0.1×107～1.0×107cell/ml，用臺盼蘭排斥試驗(yàn)證實(shí)其成活率＞95%。此懸液再以5 000 r/min離心1min得正常非激活中性粒細(xì)胞的上清液，深低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 體外血小板聚集性試驗(yàn) 按Born比濁法［3］進(jìn)行血小板聚集性的測定，即PRP分別與不同濃度的松胞菌素D藥液37℃恒溫孵育10min再加入誘導(dǎo)劑(終濃度:AA 0.35 mmol/L，ADP 3 μmol/L，PAF 7.2 nmol/L)誘導(dǎo)血小板聚集，并記錄5min內(nèi)最大聚集率，血小板聚集抑制率按下式計(jì)算:抑制率(%)=［(1-給藥組聚集率/對照組聚集率)］×100。

1.3.4 體內(nèi)血小板聚集性試驗(yàn) 10mg/kg松胞菌素D以5ml/kg的體積灌胃給藥，于給藥前和給藥后30、60、90、120、180 和240min 各取血1 次，血小板聚集性測定同體外試驗(yàn)。

1.3.5 玫瑰花結(jié)試驗(yàn) 改良Hamburger［4］方法，即取50 μl血小板與凝血酶(終濃度為0.2 U/ml)37℃溫育15min，然后加入0.9%生理鹽水(空白對照)或藥液各50 μl，繼續(xù)靜置15min，再加入中性粒細(xì)胞懸液50 μl，于4℃振蕩30min，取出少許細(xì)胞懸液，在常規(guī)記數(shù)板上于40倍鏡下隨機(jī)記數(shù)100個(gè)中性粒細(xì)胞，其周圍黏附有2個(gè)或2個(gè)以上血小板者為玫瑰花結(jié)試驗(yàn)陽性，每個(gè)樣本記數(shù)3次，取其均值，并計(jì)算玫瑰花結(jié)形成百分率。

1.3.6 松胞菌素D對激活的中性粒細(xì)胞引起血小板聚集功能的影響 將250 μl血小板懸液與50 μl中性粒細(xì)胞懸液混合成300 μl的細(xì)胞懸液，攪拌下于37℃共同溫育5min，將藥液加入上述細(xì)胞懸液中作用5min，然后加入PAF(1 μmol/L)，并按Born比濁法記錄5min內(nèi)最大聚集率。

2 結(jié)果

2.1 體外血小板聚集功能 對照組的血小板聚集率為(64.0 ±3.0)%，松胞菌素 D(5、10、25、50、100、200 μmol/L)明顯降低ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率［(62.5±3.6)%、(60.3±2.3)%、(54.2±2.1)%、(42.1±2.8)%、(32.4±5.4)%和(24.1±4.8)%］，其 IC50為108.4 μmol/L，對PAF 或 AA 誘導(dǎo)的血小板聚集無明顯抑制作用。

2.2 體內(nèi)血小板聚集功能 10mg/kg的松胞菌素D灌胃后，于30min時(shí)顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，血小板聚集率為(59.3±2.6)%，且藥效隨著時(shí)間的延長而遞增，到120min時(shí)藥效達(dá)最大(36.4±4.1)%，隨后藥效又開始減弱并持續(xù)至240min(53.7±4.4)%。

2.3 血小板—中性粒細(xì)胞黏附 松胞菌素D在5～200 μmol/L的濃度即顯著降低兩細(xì)胞間黏附率，隨濃度的升高(6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)，黏附率進(jìn)一步下降［(63.0±3.4)%、(59.0±5.6)%、(50.0±4.3)%、(40.6±2.4)%、(26.4±5.1)%、(18.2 ±4.3)%］，其 IC50為60.4 μmol/L。

2.4 激活的中性粒細(xì)胞懸液引起洗滌血小板聚集松胞菌素 D(6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)明顯抑制PAF(1 μmol/L)激活的中性粒細(xì)胞懸液引起的家兔洗滌血小板聚集率［(55.3±5.4)%、(46.1±3.8)%、(38.2±6.5)%、(30.5±3.9)%、(23.3±5.6)%、(15.3±2.7)%］，且呈濃度相關(guān)性，其 IC50為48.6 μmol/L。

3 討論

血小板在不同誘聚劑的作用下發(fā)生不同程度的活化反應(yīng)，根據(jù)活化反應(yīng)的強(qiáng)弱，可將誘聚劑分為弱誘聚劑如ADP，強(qiáng)誘聚劑如PAF，及介于二者之間的AA。本試驗(yàn)結(jié)果表明，松胞菌素D在體外、體內(nèi)對PAF、AA誘導(dǎo)的血小板聚集均無明顯抑制作用，而選擇性地抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。由于條件限制，未能進(jìn)一步探討松胞菌素D是否通過選擇性拮抗ADP受體來發(fā)揮抗血小板作用。松胞菌素D的抗血小板作用對血栓栓塞性疾病的防治具有一定的苗頭。

中性粒細(xì)胞與血小板之間的相互作用積極參與血栓的形成，激活的血小板通過釋放的5-羥色胺及血栓素等活性物質(zhì)來活化中性粒細(xì)胞，激活了的中性粒細(xì)胞能使P-選擇素快速表達(dá)并活化正常血小板，促使中性粒細(xì)胞與血小板相互黏附［5，6］，血小板與中性粒細(xì)胞間的相互作用(黏附和聚集)可介導(dǎo)血栓的形成。中性粒細(xì)胞活化后，中性粒細(xì)胞—血小板的玫瑰花結(jié)明顯增多［7］，松胞菌素D能明顯減少上述兩種細(xì)胞間的黏附作用，并與濃度正相關(guān)，提示松胞菌素D對血栓性疾病的防治可能會有積極的影響。PAF激活血小板，誘導(dǎo)P-選擇素與白細(xì)胞的P-選擇素糖蛋白配體結(jié)合，促進(jìn)白細(xì)胞與血小板之間相互黏附并在血栓部位的募集［8］。松胞菌素D對PAF直接誘導(dǎo)的血小板聚集無明顯抑制作用，而能顯著抑制ADP誘導(dǎo)的或PAF激活的中性粒細(xì)胞所引起的血小板聚集，提示被PAF激活了的中性粒細(xì)胞可能釋放了ADP，同時(shí)也提示松胞菌素D可能通過拮抗ADP來產(chǎn)生部分抑制PAF激活的中性粒細(xì)胞引起的血小板聚集作用。

綜上所述，抑制中性粒細(xì)胞的激活將有利于避免血小板的活化聚集;松胞菌素D既表現(xiàn)出明顯的抗血小板作用，還具有阻抑中性粒細(xì)胞與血小板之間的相互作用。從血栓形成現(xiàn)代新概念考慮，這比單一的抗血小板作用更有利于血栓性疾病的防治。

［1］Lo SC，Hung CY，Lin DT，et al.Involvement of platelet glycoprotein Ib in platelet microparticle mediated neutrophil activation ［J］.J Biomed Sci，2006，13(6):787-796.

［2］Ruf A，Patscheke H.Platelet-induced neutrophil activation:platelet-expressed fibrinogen induces the oxidative burst in neutrophils by an interaction with CD11C/CD18 ［J］.Br J Haematol，1995，90(4):791-796.

［3］BORN GV.Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal［J］.Nature，1962，194(6):927-929.

［4］Hamburger SA，McEver RP.GMP-140 mediates adhesion of stimulated platelets to neutrophils［J］.Blood，1990，75(3)，550-555.

［5］Bazzoni G，Dejana E，Del Maschio A.Platelet-neutrophil interactions.Possible relevance in the pathogenesis of thrombosis and inflammation ［J］.Haematologica，1991，76(5):491-496.

［6］Shen Z，Dong Z，Cheng P，et al.Effects of plumbagin on platelet aggregation and platelet-neutrophil interactions ［J］.Planta Med，2003，69(7):605-609.

［7］沈志強(qiáng)，吳藍(lán)鷗，段理，等.中性粒細(xì)胞對洗滌血小板聚集功能的影響［J］.中國病理生理雜志，2002，18(7):156-158.

［8］常亞麗，郭農(nóng)建.血小板活化因子參與血小板—中性粒細(xì)胞活化的研究［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2007，13(21):1612-1614.