張 利，黎曉敏

（西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400715）

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測基因結(jié)構(gòu)和突變的方法不斷涌現(xiàn)，尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)問世以后，各種與PCR相結(jié)合的基因檢測技術(shù)進(jìn)一步推動(dòng)了基因研究的發(fā)展。PCR是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析技術(shù)（SSCP）是一種DNA單鏈疑膠電泳技術(shù)，是以構(gòu)象為基礎(chǔ)檢測基因組中單核昔酸變異（是指基因組中單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入及缺失等形式）的方法。PCR-SSCP技術(shù)則是PCR技術(shù)和SSCP技術(shù)的結(jié)合，是現(xiàn)代遺傳學(xué)研究中用于檢測基因點(diǎn)突變和短序列缺失與插入的一種工具，其是利用不同構(gòu)象單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中泳動(dòng)速率的差異快速有效地檢測出DNA短片段中存在的單核苷酸突變，同時(shí)PCR-SSCP技術(shù)也被用于DNA定量分析，監(jiān)測PCR診斷實(shí)驗(yàn)中的交叉污染情況以及傳染源的調(diào)查等[1]。

1 PCR-SSCP技術(shù)的發(fā)展歷程

SSCP技術(shù)的建立，最早可以追溯到1984年，日本學(xué)者金澤等對獲得正常和F1-ATPase突變基因的大腸桿菌，酶切后進(jìn)行電泳分析發(fā)現(xiàn)含點(diǎn)突變的DNA小片段在中性聚丙烯酰胺凝膠中的單鏈電泳遷移率與相應(yīng)正常的DNA小片段的單鏈電泳遷移率明顯不同[2]。1989年，日本學(xué)者Orita等將此法用于檢測復(fù)雜基因組中單拷貝DNA中的多態(tài)現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，當(dāng)有堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或少的影響其空間構(gòu)象，從而空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受到的阻力不同而導(dǎo)致電泳速度不同[3]。隨后的研究中，Orita又將SSCP技術(shù)用于檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因突變，從而使得分析變得更加靈敏，并且在原來的基礎(chǔ)上省去了酶切等步驟，進(jìn)而改進(jìn)了SSCP技術(shù)[4]。Ainsworth等成功地把銀染技術(shù)用于PCR-SSCP分析[5]。并且日本學(xué)者Hoshino等在1992年也將同位素標(biāo)記法改為敏感的銀染法，增強(qiáng)了安全性，使得方法簡便、快捷[6]。此后，Maruya等建立了PCR-LIS-SSCP技術(shù)用于HLA分型，Iwahana等用MF-PCR-SSCP檢測人類K-ras突變，毛細(xì)管電泳技術(shù)與SSCP相結(jié)合用于同源和異源點(diǎn)突變的檢測等都是PCR-SSCP技術(shù)的改進(jìn)和發(fā)展[7-8]。

SSCP技術(shù)值得注意的改進(jìn)是將DNA-SSCP分析改為RNA-SSCP分析，原因是RNA有更多精細(xì)的二級構(gòu)象，對單個(gè)堿基的突變很敏感，使得檢出率提高；而且RNA不易結(jié)合成雙鏈，可以較大量的進(jìn)行電泳，有利于染色，只是該方法增加了一個(gè)反轉(zhuǎn)錄過程，需要一個(gè)較長的引物，內(nèi)含有啟動(dòng)RNA聚合酶的啟動(dòng)序列，從而相對增加了難度。為了進(jìn)一步提高檢出率，SSCP分析逐步發(fā)展為與其他突變檢測方法相結(jié)合，特別是與雜交雙鏈分析（Het）法結(jié)合大大的提高了檢出率，可以使點(diǎn)突變的檢出率接近100%。

2 PCR-SSCP技術(shù)的原理及操作過程

PCR-SSCP是一種簡單、有效、快捷、廉價(jià)的檢測少量基因組DNA或cDNA突變的技術(shù)，是近年發(fā)展起來的一種基因分析方法。其是以構(gòu)象為基礎(chǔ)檢測基因組中單核昔酸變異（SNP），是繼第一代作圖用分子標(biāo)記（RFLP）、第二代作圖分子標(biāo)記（微衛(wèi)星標(biāo)記）之后的第三代作圖用分子標(biāo)記方法之一，也是目前廣泛應(yīng)用于分析分子種群生物學(xué)特征、遺傳性疾病檢測及特定功能基因或片段分型等的標(biāo)記方法之一。該方法的基本原理是經(jīng)PCR擴(kuò)增的目的片段在變性劑或低離子濃度下經(jīng)高溫處理使之解鏈并保證在單鏈狀態(tài)下，然后在一定濃度的非變性聚丙稀酰胺凝膠中電泳，單鏈DNA遷移率除與DNA濃度有關(guān)外，更主要取決于DNA單鏈所形成的空間構(gòu)象即單鏈DNA的遷移率是序列依賴性的。相同長度的單鏈DNA，可以因其順序或單個(gè)堿基差異，所形成的空間構(gòu)象就會(huì)不同，其在凝膠中泳動(dòng)速度不一樣，從而顯示出帶型的差異即多態(tài)型[9-10]。

PCR-SSCP技術(shù)是PCR技術(shù)與SSCP技術(shù)的結(jié)合，其操作過程是PCR擴(kuò)增靶DNA；將特異的PCR產(chǎn)物變性，而后迅速冰浴，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子；將適量的單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果。若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變。

PCR-SSCP技術(shù)可以檢測任何（包括已知的和未知的）DNA位點(diǎn)上的多態(tài)性和突變，但適合于檢測小片段的DNA片段，片段長度要求＜500 bp，100～300 bp的片段最適合于PCR-SSCP分析，因?yàn)镈NA過長，單鏈形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的機(jī)會(huì)較少。當(dāng)片段為200 bp時(shí)，單個(gè)堿基突變的檢出率高于90%，當(dāng)片段為400 bp時(shí)，單個(gè)堿基突變的檢出率為80%以上，隨著DNA片段的長度加大，其檢出率逐漸降低[11]。

3 PCR-SSCP技術(shù)的研究現(xiàn)狀

PCR-SSCP技術(shù)作為一種分子生物學(xué)技術(shù)日漸得到發(fā)展和完善，如今在多個(gè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，人醫(yī)上用于癌基因和抑癌基因突變的檢測、連鎖反應(yīng)及基因作圖等，在獸醫(yī)臨床上也越來越多的應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌種鑒定、細(xì)菌耐藥基因突變檢測、遺傳疾病基因突變分析等。

宋薇薇等通過分離肺結(jié)核患者痰中的DNA，采用PCR-SSCP分析檢測出絕大部分耐多藥結(jié)核病的耐藥基因，其中rpoB、katG、rpsL基因突變與結(jié)核桿菌對′RFP、INH、SM耐藥性有關(guān)，與傳統(tǒng)L-J藥敏實(shí)驗(yàn)相比更敏感和快速，從而探討了PCR-SSCP技術(shù)作為新的藥敏方法在臨床上的應(yīng)用價(jià)值[12]。鄭東鈞等應(yīng)用PCR-SSCP結(jié)合RFLP技術(shù)檢測葡萄球菌的gyrA基因突變及norA基因，快速準(zhǔn)確地檢測多種細(xì)菌gyrA基因中1個(gè)或多個(gè)堿基的差異[13]。這些都是將PCR-SSCP技術(shù)應(yīng)用于基因突變檢測。

在細(xì)菌種快速、準(zhǔn)確診斷中，楊文敏等應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)對5種食源致病菌進(jìn)行了16S rRNA的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)該方法有助于食物中毒致病菌的快速檢測[14]。蔡暢等應(yīng)用該方法進(jìn)行鴨疫里默氏菌（RA）16S rRNA基因的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，為其分類鑒定提供了分子指標(biāo)[15]。

獸醫(yī)臨床上也將PCR-SSCP技術(shù)用于寄生蟲研究，主要是寄生蟲分類學(xué)研究、蟲種（株）的鑒定等方面。Li等以核糖體DNA第2內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（1TS-2）作為遺傳標(biāo)志，用PCR-SSCP分析成功鑒別了兩種不同的豬結(jié)節(jié)蟲第3期幼蟲[16]。Lin等以PCR-SSCP方法為基礎(chǔ)，通過描述體內(nèi)的核糖體DNA轉(zhuǎn)錄區(qū)，描繪出了中國豬的結(jié)節(jié)線蟲屬性狀特征圖[17]。很多研究者也用該方法用于病毒的分型及變異，監(jiān)測PCR實(shí)驗(yàn)中的污染情況、病原體傳播途徑的研究。

PCR-SSCP技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于檢測引起各種遺傳病的基因突變，分析群體遺傳、基因分型等，揭示遺傳基因演化規(guī)律。李根銀等試驗(yàn)表明，應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)對5個(gè)豬種DECR1基因外顯子2單鏈構(gòu)象多態(tài)性進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，探討了豬種的群體遺傳平衡狀態(tài)即穩(wěn)定性[18]。陳杰等應(yīng)用該方法對豬的FSHβ亞基位點(diǎn)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其可以作為高繁殖力選擇的遺傳標(biāo)記[19]。

4 小結(jié)

PCR-SSCP技術(shù)自建立以來，已廣泛用于分子生物學(xué)的各種領(lǐng)域，而且正在發(fā)揮著巨大的作用，特別是在遺傳性疾病基因突變分析、病原微生物鑒定中得到越來越多的應(yīng)用，可以和DNA指紋技術(shù)、RFLPs技術(shù)相互結(jié)合在遺傳資源的調(diào)查中發(fā)揮作用，從而為利用遺傳資源提供理論依據(jù)。在不久的將來，PCR-SSCP技術(shù)在遺傳變異研究中將會(huì)得到更為廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。

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