張艷梅，楊雨旸，孫 堯

(1河北聯(lián)合大學(xué)，河北唐山063000;2河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院)

已有研究［1，2］證實(shí)脂聯(lián)素水平與冠心病密切相關(guān)，因其與糖尿病和心血管病的潛在聯(lián)系，其基因多態(tài)性近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。其中研究的熱點(diǎn)集中在+45T/G和+276G/T單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，但研究結(jié)果因樣本量、年齡、種族差異，不盡相同。2008年8月～2010年8月，我們通過(guò)對(duì)河北唐山地區(qū)冠心病及非冠心病的老年人脂聯(lián)素基因(APM-1)第2外顯子+45位點(diǎn)基因型的分布情況進(jìn)行大樣本調(diào)查，探討脂聯(lián)素SNP+45G/T與老年冠心病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 病例組選擇河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科住院患者149例，均確診為冠心病，其中男99例、女50例，年齡65～89(77±12)歲。經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)主要?jiǎng)用}(左前降支、左回旋支、右冠狀動(dòng)脈)中至少有1支內(nèi)徑狹窄＞50%，同時(shí)排除糖尿病。對(duì)照組為通過(guò)體檢確定為未患有冠心病、糖尿病的正常健康人167例，其中男111例、女56例，年齡64～84(74±10)歲。所有受試對(duì)象彼此之間無(wú)血緣關(guān)系，有近期服藥史者、患有嚴(yán)重的肝腎疾病者均排除本研究之外。兩組間年齡、性別構(gòu)成比相匹配。樣本采集遵循“知情同意”原則。

1.2 樣本采集 所有研究對(duì)象采集空腹靜脈血5 ml，其中3 ml分離血清用于生化指標(biāo)測(cè)定，2 m l用于基因組DNA提取。同時(shí)測(cè)量身高、體質(zhì)量、腹圍、臀圍等。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法 采用苯酚—氯仿法提取基因組DNA。參照GenBank中APM序列自行設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物。5'-GCAGCTCCTAGAAAGTAGACTCTGCTG-3'，反向引物為 5'-GCAGGTCTGTGATGAAAGAGGCC-3'。擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為372 bp。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性2 min后，95℃變性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸40 s，共完成30個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠(含0.5μg/ml溴化乙啶)60 V恒壓電泳30 min，紫外透射儀觀察結(jié)果后，置冰箱－4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切:限制性酶切反應(yīng)在20μl體系中進(jìn)行，其中包括10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，10 U/μl SmaⅠ限制性內(nèi)切酶3 U(MBI)及 Bufer 2 μl(MBI)，總體系 20 μl，輕輕混勻后置于37℃恒溫水浴箱中消化4～6 h。酶切后電泳。DNA序列分析:隨機(jī)抽取不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定(上海生工測(cè)序部)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Excel和SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以±s表示。組間差異采用χ2檢驗(yàn)和單因素方差分析，用LSD方法進(jìn)行兩兩比較。以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?；蛐皖l率的觀察值與預(yù)期值比較用Hardy Weinberg(H-W)平衡檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 見表1。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 經(jīng)SmaⅠ酶切電泳后產(chǎn)生3種基因型，野生型(T/T)顯示1條帶(372 bp)，雜合子型(T/G)顯示 3 條帶(372、209、163 bp)，純合子突變型(G/G)顯示2條帶(209、163 bp)。

表1 病例組與對(duì)照組一般臨床資料比較(±s)

表1 病例組與對(duì)照組一般臨床資料比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05

組別 BMI(kg/m2) SBP(mmHg) DBP(mmHg) TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)病例組 24.41 ±2.37 135.17 ±20.76* 82.49 ±10.78 5.12 ±1.01* 2.26 ±1.25* 0.97 ±0.32 3.01 ±0.79*對(duì)照組 23.89 ±2.68 124.99 ±17.90 79.94 ±10.58 4.30 ±0.63 1.52 ±0.94 0.87 ±0.20 1.87 ±0.61

2.3 等位基因和基因型頻率比較 對(duì)各組基因型頻率進(jìn)行平衡檢驗(yàn)，均符合H-W遺傳平衡，故認(rèn)為能夠代表群體的基因分布。SNP+45(T/G)的3種基因型頻率在病例組和對(duì)照組間的分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=7.917，P=0.019)，2 種等位基因頻率在兩組間的分布也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=5.057，P=0.025)。見表 2。

表2 APM-1基因+45位點(diǎn)等位基因及基因型頻率的比較［例(%)］

3 討論

脂聯(lián)素是新近發(fā)現(xiàn)的由脂肪組織特異性分泌的蛋白質(zhì)。人類APM-1是單拷貝基因，全長(zhǎng)約17 kb，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，定位于染色體3q27，此區(qū)域存在2型糖尿病、代謝綜合征和冠心病的易感位點(diǎn)［3～5］，因此針對(duì)于SNPs與疾病相關(guān)性的研究已經(jīng)成為近年來(lái)的熱點(diǎn)。

目前已明確APM-1多態(tài)性與肥胖、2型糖尿病、胰島素抵抗等有一定的相關(guān)性，但與冠心病的相關(guān)性研究報(bào)道較少。有研究顯示SNP+45與血漿脂聯(lián)素水平無(wú)相關(guān)性，與胰島素抵抗密切相關(guān)，攜帶G/G基因型的人群發(fā)生2型糖尿病的危險(xiǎn)性增加［6，7］。國(guó)外有研究顯示SNP+45位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病顯著相關(guān)，并且獨(dú)立于傳統(tǒng)的冠心病危險(xiǎn)因素［8］。本研究結(jié)果顯示，唐山地區(qū)老年冠心病患者SNP+45位點(diǎn)G/G基因型明顯多于對(duì)照人群，等位基因分布分析提示G等位基因在冠心病病人群中多見，提示攜帶SNP+45G/G基因型的個(gè)體更易發(fā)展為冠心病。脂聯(lián)素基因SNP+45多態(tài)性為同義突變，雖然這個(gè)SNP并沒(méi)有引起氨基酸序列的變化，推測(cè)該位點(diǎn)可能與一個(gè)致病變異呈高度連鎖不平衡，所以此處核苷酸序列的改變影響了蛋白質(zhì)表達(dá)的效率。另外我們還發(fā)現(xiàn)老年冠心病組SBP、TC、TG和LDL-C水平顯著增高，提示冠心病與環(huán)境因素相關(guān)，與以往研究相符。

本研究從一定角度揭示了APM-1與唐山地區(qū)老年冠心病的關(guān)系，但冠心病為多因素、多基因性疾病，單個(gè)基因的作用有限，基因研究可因病例的入選標(biāo)準(zhǔn)、樣本量及研究對(duì)象不同，結(jié)果有所不同。因此，有必要擴(kuò)大研究對(duì)象數(shù)量以及開展對(duì)不同種族的研究。

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