高效液相色譜法測定常見藥物中的亞硝酸鹽含量

黃麗華，許湃彬

1.長沙市婦幼保健院藥劑科，湖南長沙 410007；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥劑科，湖南長沙 410011

亞硝酸鹽具有保鮮、防腐、使用后顏色鮮艷等功效，是很多藥物的添加劑；但是過量有嚴(yán)重的毒性，是致癌物質(zhì)N-亞硝胺的重要前體[1]。隨著人們環(huán)境意識和藥物安全意識的加強(qiáng)，亞硝酸根成為藥物分析的重要項(xiàng)目[2]。近年來，國內(nèi)外已報(bào)道的測定亞硝酸鹽的方法很多，其中分光光度檢測法和電化學(xué)檢測法操作簡單，設(shè)備成本低，可作為教學(xué)與實(shí)用性檢測手段，但檢出限高、靈敏度與特異性較低[3-4]。高效液相色譜靈敏度高，檢出限低，特異性高，適于分析常見藥物中的微量亞硝酸鈉含量[5]。本實(shí)驗(yàn)利用經(jīng)過優(yōu)化色譜和衍生化條件，測定常見藥物中的亞硝酸鹽，效果較好，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀Agilent 100（美國安捷倫科技有限公司），HPI 100熒光檢測器 （美國惠普科技有限公司），AE260S電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），攪碎機(jī)（上海生物工程器械制造有限公司），Milli-Q50高純水處理器（日本日立公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)液的制備

將亞硝酸鈉試劑置于100℃烘箱中烘烤24 h，準(zhǔn)確稱取0.01 g于50 ml的燒杯中，滴入0.5 ml氫氧化鈉，0.1 ml三氯甲烷，雙蒸水溶解然后轉(zhuǎn)移至500 ml的容量瓶中，最后用雙蒸水定容至刻度，濃度為20μg/ml（標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液）。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2 ml，置于100 ml容量瓶中，雙蒸水定容至刻度，該使用液亞硝酸鈉濃度為 0.4 μg/ml。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取藥物均質(zhì)試樣5.0 g，置于50 ml燒杯中，加入35 ml的蒸餾水，使用玻璃棒混勻，靜置10 min后再加入1 mol/L NaOH溶液1 ml，1.1 mol/L乙酸鋅溶液1 ml混勻靜置10 min。

1.4 色譜條件

流動(dòng)相 V（雙蒸水）∶V（乙腈）=60∶40；高效液相檢測波長：激發(fā)波長375 nm，發(fā)射波長415 nm；流速：0.8 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；進(jìn)樣方式：自動(dòng)式進(jìn)樣；柱溫：50℃。

1.5 分析方法

定性依據(jù)：取高中低三個(gè)濃度梯度的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)DNA衍生化反應(yīng)后，響應(yīng)值與濃度成比例增長的色譜峰為目標(biāo)化合物色譜峰，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，樣品測試液中色譜峰與亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜峰保留時(shí)間一致，可判定為樣品測試液中含有目標(biāo)化合物。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別吸取濃度為20μg/ml亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.025、0.050、0.100 ml于1 000 ml容量瓶定容至刻度；另分別吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 0.5、1.0、2.0、2.5 ml于250 ml容量瓶定容至刻度。 得到濃度分別為 0.000 5、0.001、0.002、0.04、0.08、0.16、0.20μg/ml，按前述條件衍生化反應(yīng)后進(jìn)行色譜測定，由數(shù)據(jù)得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，在濃度為0.000 5~0.299μg/ml呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=4 520.2X，相關(guān)系數(shù)，r=0.999 9。

2.2 回收率與精密度的測定

取阿莫西林、頭孢曲松鈉、頭孢唑肟鈉三種樣品做回收試驗(yàn)。見表1。

3 討論

亞硝酸鈉是一種良好的食品與藥物添加劑，不僅能防腐、保鮮，還能抑制肉毒桿菌的繁殖；但亞硝酸鈉也有極大的危害性，其含量于人體血液中0.4~200.0 mg/kg時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性，使人體內(nèi)正常血紅蛋白轉(zhuǎn)變成高鐵血紅蛋白，從而失去攜氧功能，還能與人體中的二級胺或三級胺結(jié)合轉(zhuǎn)化成強(qiáng)烈致癌物質(zhì)——亞硝胺從而誘發(fā)癌變[6]，危害相當(dāng)大。亞硝酸鈉在藥物中的普遍微量存在使檢測工作面臨極大挑戰(zhàn)，當(dāng)前亟需建立一種高效、靈敏、省時(shí)省力、成本低的檢測方法。亞硝酸鈉的檢測方法主要有分光光度計(jì)法、電化學(xué)檢測法、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等[7]。其中一些雖然操作簡單、費(fèi)用較低，但靈敏度不高；還有一些方法檢測限低，但儀器設(shè)備過于昂貴[8]。

表1 亞硝酸鈉在藥物中的平均加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

本文建立了經(jīng)柱前衍生化高效液相色譜法熒光檢測水產(chǎn)品中的亞硝酸鈉的方法。實(shí)驗(yàn)過程采用微量化操作，所用試劑成本較低，前處理方法簡單，避免了離子干擾。通過改進(jìn)色譜條件，優(yōu)化亞硝酸鈉與衍生化條件，色譜分離更好。最低檢出限為0.01 mg/kg，甚至更低，解決了以往分光光度計(jì)法檢測靈敏度低的狀況，回收率在85.6%~95.5%之間，方法平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.4%~2.6%之間，在0.000 5~0.299μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 9，此方法也適合于其他藥物中亞硝酸鈉的檢測。

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