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      箬葉多糖對體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞的抑制作用

      2011-06-20 03:20:04王恩軍盧雪崢李雙成
      中國民族民間醫(yī)藥 2011年18期
      關(guān)鍵詞:箬葉箬竹抑制率

      劉 超 靳 祎 王恩軍 盧雪崢 李雙成

      1.河北省保定市第一中心醫(yī)院眼一科,河北 保定 071000;2.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000;3.河北省保定市第一中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 保定 071000;4.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 石家莊 050017

      箬葉是禾本科植物箬竹 (Indocalamus tesselatus)的葉。它味甘性寒,有清熱止血、解毒消腫之效,可以治療吐血、下血、小便不利、喉痺、癰腫等病癥[1、2]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)箬葉中含有多種維生素、氨基酸、茶多酚、礦物質(zhì)、多糖、黃酮類物質(zhì)和各種芳香成分[3],其中箬葉及箬竹根所含的多糖,對體內(nèi)實驗動物腫瘤具有抑制作用[4-6]。本試驗采用人宮頸癌Hela細(xì)胞作為試驗?zāi)P?,研究箬葉多糖對體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞的抑制作用,為宮頸癌的臨床治療提供參考依據(jù)。

      1 材料和方法

      1.1 材料 ①箬葉多糖:由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院提供,采用苯酚-硫酸法測定多糖含量為49.08%。試驗前制成500 mg/mL的溶液,過濾除菌4℃保存,原生藥購自江西九江市;②人宮頸癌細(xì)胞株Hela:由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院提供。

      1.2 儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱:美國SHELDON公司;凈化工作臺:蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;酶標(biāo)儀:鄭州博塞生物工程公司;倒置顯微鏡:奧林巴斯CKX41;48孔及96孔培養(yǎng)板:美國Costar公司;胎牛血清:天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司;DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶:GIBCO公司;順鉑:齊魯制藥有限公司;四甲基偶氮唑鹽 (MTT)、二甲基亞砜 (DMSO):美國Sigma公司。

      1.3 方法

      1.3.1 Hela細(xì)胞的體外培養(yǎng) 將Hela細(xì)胞貼壁生長于DMEM完全培養(yǎng)液體系 (含10% 胎牛血清,青霉素和鏈霉素各100 U/mL),置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時用DMEM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個/mL的細(xì)胞懸液待用。

      1.3.2 MTT法檢測箬葉多糖對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用按2×105個/mL的細(xì)胞密度將Hela細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中,終體積為每孔200 μL。試驗分三組,陰性對照組加入生理鹽水,陽性對照組加入順鉑 (濃度為20 μg/mL),實驗組加入不同濃度的箬葉多糖,終濃度分別為25 mg/mL,50 mg/mL,100 mg/mL,200 mg/mL,并設(shè) 4個平行孔,分別培養(yǎng)24h、48h和72h后加入MTT液 (5 μg/μL)20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄上清液,加入DMSO每孔150 μL,震蕩15 min,測定吸光度值 (A值),測定波長λ=570 nm,參考波長 λ=630 nm,計算抑制率 (Grow inhibitory rate,GIR):

      抑制率 (%)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%,并計算箬葉多糖對Hela細(xì)胞半抑制率(IC50)。

      1.3.3 形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),培養(yǎng)24 h,實驗組加入100 mg/mL的箬葉多糖,對照組加入生理鹽水,培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

      1.3.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用The SAS system 6.12統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間數(shù)據(jù)用t檢驗。

      2 結(jié)果

      2.1 箬葉多糖對體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞的抑制作用

      2.1.1 箬葉多糖對Hela細(xì)胞抑制作用的量效關(guān)系 Hela細(xì)胞經(jīng)不同濃度的箬葉多糖作用48 h后,細(xì)胞抑制作用明顯,且隨著藥物濃度的升高,抑制率逐漸增強,劑量效應(yīng)關(guān)系顯著,與陰性對照組比較差異顯著 (P﹤0.05)(表1)。

      表1 不同濃度的箬葉多糖對Hela細(xì)胞的抑制作用n=4,

      表1 不同濃度的箬葉多糖對Hela細(xì)胞的抑制作用n=4,

      注:與對照組相比,#P﹤0.05,▲P﹤0.01

      2.1.2 箬葉多糖對Hela細(xì)胞抑制作用的時效關(guān)系 4種不同濃度的箬葉多糖作用于Hela細(xì)胞24、48、72 h,Hela細(xì)胞的受抑制程度與時間有關(guān),隨著作用時間的延長,抑制作用明顯增強,具有良好的時效關(guān)系 (表2)。

      表2 箬葉多糖不同作用時間對Hela細(xì)胞的抑制率n=4,

      表2 箬葉多糖不同作用時間對Hela細(xì)胞的抑制率n=4,

      2.1.3 箬葉多糖對Hela細(xì)胞抑制作用的IC50

      通過MTT法作出的Hela細(xì)胞生長曲線得出箬葉多糖抑制細(xì)胞生長50%時的濃度為157 mg/mL(48h)。

      2.2 形態(tài)學(xué)觀察 對照組宮頸癌Hela細(xì)胞呈扁平的不規(guī)則長梭形或多角形,核圓形,位于中央,排列無方向性,細(xì)胞邊緣清楚,培養(yǎng)基內(nèi)懸浮的細(xì)胞和碎片少;實驗組箬葉多糖作用Hela細(xì)胞,胞膜起皺,數(shù)量減少,細(xì)胞呈圓形,與周圍細(xì)胞脫離,培養(yǎng)基內(nèi)懸浮的細(xì)胞和碎片多。

      3 討論

      宮頸癌在女性惡性腫瘤中,發(fā)病率僅次于乳腺癌而位居第二。它占據(jù)了生殖器官癌癥的一半以上,更是生育期和更年期這兩個階段發(fā)病率最高的疾病。臨床上治療宮頸癌主要采取手術(shù)、放化療等綜合治療,但它們所帶來的并發(fā)癥也很多,而且化療藥物本身費用昂貴、久易耐藥、毒性較大。而傳統(tǒng)中醫(yī)藥積累了大量治療婦科疾病的經(jīng)驗與驗方,辨證論治對減少宮頸癌化療和放療的副作用均有較好的輔助作用,這對鞏固和加強宮頸癌的治療效果,延長患者生命和保證生存質(zhì)量是具有積極意義的[7]。

      箬葉,俗稱竹箬、箬皮,即箬竹的葉子,別名遼葉、茶篰若葉,為禾本科植物箬竹的葉。箬竹是一種個子較矮的竹子,分布于東南亞一帶,我國長江流域均有栽種,它葉片巨大,又有特殊芳香,用來裹粽最為適宜。箬葉除用于裹粽外,還有藥用價值。上世紀(jì)80年代,德國和日本的醫(yī)學(xué)家發(fā)現(xiàn),中國包粽子的箬葉有抗癌作用。報告說,箬葉除一般營養(yǎng)成分外,還含有一種箬竹多糖,具有殺菌、防腐、抗癌的功用,日本已經(jīng)用箬竹葉中提取的多糖來治療喉、舌、胃、食管、鼻咽、腹腔等癌癥,療效顯著。

      本試驗使用人宮頸癌Hela細(xì)胞作為代表細(xì)胞株,采用MTT法觀察不同濃度的箬葉多糖對人宮頸癌細(xì)胞的作用。結(jié)果表明:不同濃度的箬葉多糖作用細(xì)胞后,對體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞有較強的抑制作用;且抑制程度與箬葉多糖的濃度和作用時間有關(guān)。濃度越高抑制作用越強,作用時間越長抑制效果越明顯,顯示典型的量效關(guān)系和時效關(guān)系,對Hela細(xì)胞的IC50為157 mg/mL。另外細(xì)胞毒性的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示箬葉多糖作用于細(xì)胞后,可看到較為典型的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化,說明箬葉多糖對體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞有明顯的抑制作用,這為今后進(jìn)一步研究箬葉的抗腫瘤作用機制提供了試驗依據(jù)。

      [1]艾文勝,湯騰方,楊建勝等.箬竹利用現(xiàn)狀及葉用園營建技術(shù)[J].林業(yè)科技開發(fā),2006,20(1):69-71.

      [2]季宇彬.中藥多糖的化學(xué)與藥理[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005,226-230.

      [3]李水芳,李姣娟.箬葉化學(xué)成分的比較研究[J].食品研究與開發(fā),2008,29(12):7-10.

      [4]陳春英,丁玉強,E.A.ELMAHADI等.堿液提取箬葉多糖的純化及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)的研究[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1999,26(1):51-55.

      [5]蔣巖,陳春英,裴麗健等.硫酸酯化箬葉多糖抗HIV-1機制的初步研究[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志,2000,14(1):56-59.

      [6]張賽丹,方巖雄,陳敏敏等.幾種傳統(tǒng)中藥中多糖的提取及抗腫瘤活性研究[J].中藥材,2007,30(2):179-182.

      [7]關(guān)素潔.宮頸癌的發(fā)病機制及中醫(yī)藥治療研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報,2007,13(2):95-97.

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