文 迪，馬春玲，叢 斌，張雅靜，2，楊勝昌，孟雁欣，于 峰，倪志宇，李淑瑾

(1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，河北省法醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北石家莊 050017;2.石家莊市第一醫(yī)院，河北石家莊 050011)

長期反復(fù)使用外源性阿片類藥物，打破了內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)的平衡，復(fù)雜的神經(jīng)、內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)變化過程中存在多種生物活性物質(zhì)的分泌和變化，以適應(yīng)進入體內(nèi)的大量阿片類物質(zhì);一旦停止用藥，可引起機體機能功能紊亂，出現(xiàn)一系列的戒斷癥狀。八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)是迄今體內(nèi)最強的抗阿片肽類物質(zhì)［1］，參與調(diào)節(jié)疼痛、焦慮情緒、記憶和認知等過程［2］。外源性和內(nèi)源性阿片物質(zhì)均可促進中樞CCK基因的表達和生物合成以及CCK-8的釋放;我室以往的研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡可使大鼠原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上CCK1及CCK2受體 mRNA表達上調(diào)，并以 CCK2受體為主［3－4］，說明CCK在阿片成癮過程中也發(fā)揮著重要作用。本研究旨在觀察CCK-8及CCK受體拮抗劑對嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的影響，并檢測CCK-8對大鼠腦組織 μ阿片受體結(jié)合活性的影響，探討CCK-8在嗎啡依賴過程中的作用及其相關(guān)受體機制，為CCK-8在戒毒方面的應(yīng)用提供相關(guān)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 成年♂Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(200±10)g，由河北省實驗動物中心提供(實驗動物質(zhì)量合格證:901014)。鹽酸嗎啡(沈陽第一制藥廠);鹽酸納洛酮、CCK-8、DAMGO(美國 Sigma公司);devazepide、LY-288，513(英國 Tocris公司);［3H］-DAMGO(放射比活度 2.1 × 1015Bq·mol－1，濃度3.7 ×1010Bq·L－1，美國 PE 公司)，GF-B 型玻璃纖維濾膜(英國Whatman公司)。Angel Two腦立體定位儀(美國MyNeurolab公司);微量注射泵(美國KdScientific公司);微量注射套管(深圳瑞沃德生命科技有限公司);LS-6500型液體閃爍計數(shù)儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 動物模型的建立及分組 參照文獻［5］建立大鼠慢性嗎啡依賴及急性催促戒斷模型:以劑量遞增法連續(xù)皮下注射嗎啡(10、20、30、40、50 mg·kg－1)5 d，每天2 次，間隔12 h(8:00、20:00)。d 6 8:00 皮下注射嗎啡50 mg·kg－1，2 h后腹腔注射鹽酸納絡(luò)酮(5 mg·kg－1)進行催促戒斷，記錄戒斷后大鼠軀體戒斷癥狀，包括戒斷后15 min內(nèi)跳躍次數(shù)、齒顫、濕狗樣抖動、腹瀉、血淚、流涎、激惹及1 h后體重變化，用改良 Gellert-Holtzman法［6］進行戒斷癥狀的評價，具體評價方法見Tab 1。大鼠隨機分組如下:①鹽水對照組(Control):背部皮下注射同等劑量的生理鹽水;②嗎啡依賴組(Mor):按照上述方案進行嗎啡皮下注射;③納洛酮催促戒斷組(Mor-Nal):按照上述方案給予嗎啡皮下注射后2 h進行納洛酮催促戒斷;④慢性藥物干預(yù)組(CCK-8，Dev，LY-288，513-Mor-Nal):給予嗎啡前 10 min側(cè)腦室注射 CCK-8(0.1 μg)，devazepide(1 μg)，LY-288，513(1 μg)，余同③;⑤溶劑對照組(Veh-Mor-Nal):給予嗎啡前10 min，注射同等體積的溶劑(DMSO∶1，3-丙二醇=1∶4，2 μl)，余同③。

Tab 1 Gellert-Holtzman scale

1.3 大鼠腦立體定位及腦室注射 戊巴比妥鈉40 mg·kg－1腹腔注射麻醉大鼠，取顱骨正中切口，10%H2O2進行燒灼，充分暴露顱骨表面前囟、人字縫等表面標志。核團定位以前囟為參照零點，用牙科鉆打孔后通過立體定位儀的操作桿將微量注射套管 (外徑0.6 mm，內(nèi)徑0.4 mm)插入腦內(nèi)(AP，－1.67;ML，±0.92;DV，－3.10)用于腦室內(nèi)給藥，并用502膠及牙科水泥將微量注射套管固定于顱骨表面，術(shù)后預(yù)防性給予抗生素3 d。注射時將套管針芯拔出，插入內(nèi)注射管，連接PE管和微量注射器進行注射。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)7 d后開始實驗，側(cè)腦室注射體積 2 μl，注射速度 0.5 μl·min－1，注射完后留針 5 min。實驗完畢后通過套管注射 2 μl 0.1%臺盼藍，取腦觀察腦室是否藍染，剔除定位不準確的動物，最后保證每組6只動物。

1.4 大鼠腦組織膜受體蛋白的制備 大鼠斷頭取腦，加入10倍體積預(yù)冷的組織裂解液(50 mmol·L－1Tris-Cl pH 7.4，0.32 mol·L－1蔗糖，5 mg·L－1Aprotinin，5 mg· L－1Leupeptin，1 mmol· L－1PMSF，5 mmol·L－1EDTA)，冰浴下高速勻漿 1 min。冰浴孵育30 min，并用1 ml注射器反復(fù)抽吸5～6次，使其充分裂解。低速離心 10 min(4℃，1 000×g)，取上清超速離心20 min(4℃，20 000×g)，沉淀用 Tris-Cl緩沖液(50 mmol·L－1，pH 7.4)充分懸浮后，再次超速離心20 min(4℃，20 000×g)后將沉淀懸浮備用?？捡R斯亮藍蛋白定量試劑盒(微板法)測定蛋白濃度后，用Tris-Cl緩沖液調(diào)整濃度至 1 g·L－1。

1.5 放射配基結(jié)合反應(yīng) 總結(jié)合管中加入100 μl Tris-Cl緩沖液、100 μl膜蛋白制備液、100 μl［3H］－DAMGO(0.5 ～8 nmol·L－1);非特異結(jié)合管中加入 50 μl Tris-Cl緩沖液、100 μl膜蛋白制備液、50 μl DAMGO(5 μmol·L－1)、100 μl［3H］-DAMGO，總體積為300 μl，均做3個平行復(fù)管。充分混勻后4℃孵育過夜，次日在冰水浴中靜置3 min終止反應(yīng)，迅速通過玻璃纖維濾膜負壓抽濾，分離未結(jié)合的標記配基，并用4 ml預(yù)冷的Tris-Cl緩沖液沖洗濾膜。取出濾膜經(jīng)80℃ 40 min烤干，置于裝有2 ml閃爍液(PPO 0.3 g，POPOP 3 g，二甲苯1 L)的 EP管中靜置過夜，將 EP管放入閃爍杯中用 Beckman LS-6500型液體閃爍計數(shù)儀測量放射性活度(count perminute，CPM)。特異結(jié)合(specific binding，SB)為總結(jié)合(total binding，TB)與非特異結(jié)合(non-specific binding，NSB)之差。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 ［3H］-DAMGO與μ阿片受體結(jié)合的平衡解離常數(shù)(Kd)和最大結(jié)合容量(Bmax)由GraphPad software進行分析，用Scatchard作圖法經(jīng)直線回歸方程求得。所得數(shù)據(jù)用SPSS11.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，以±s表示，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較。戒斷癥狀評價中觀察癥狀(Checked signs)以組內(nèi)出現(xiàn)癥狀動物的百分數(shù)表示，組間差異采用Exact Logistic回歸模型進行比較。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8及其受體拮抗劑對嗎啡成癮大鼠戒斷癥狀的影響 嗎啡依賴大鼠在給予納絡(luò)酮催促戒斷后，觀察到齒顫、濕狗樣抖動、腹瀉、血淚、流涎、激惹、跳躍、體重明顯下降等戒斷癥狀，戒斷組Gellert-Holtzman評分為(37.6±4.1)，與對照組(3.9 ±0.6)相比差異有顯著性(P＜0.01)。在嗎啡注射前10 min側(cè)腦室注射CCK1受體拮抗劑Devazepide和CCK2受體拮抗劑LY-288，513慢性干預(yù)均能降低嗎啡成癮大鼠的戒斷癥狀評分，其Gellert-Holtzman評分分別為(26.2±3.3)、(14.8±2.7)，與戒斷組相比差異均有顯著性(P＜0.01)，且 LY-288，513的作用優(yōu)于Devazepide(P＜0.01);給予外源性 CCK-8(CCK受體激動劑)慢性干預(yù)同樣可減輕嗎啡依賴大鼠的戒斷癥狀，其評分為(15.6±0.7)，與 CCK受體拮抗劑的作用一致(Fig 1)。CCK-8及其受體拮抗劑均可不同程度地改善體重下降(Fig 2)、跳躍、齒顫、流涎等戒斷癥狀(Tab 2)。

Tab 2 Effects of CCK-8，devazepide and LY-288，513 on checked signs of morphine withdrawal(±s，n=6)

Tab 2 Effects of CCK-8，devazepide and LY-288，513 on checked signs of morphine withdrawal(±s，n=6)

Each of the listed signs was checked if present at any point during the 15 min observation session.The data was then converted to the percentage of rats in a particular experimental group which displayed that sign during the observation period.▲P ＜0.05 vs control;*P ＜0.05 vs Mor-Nal group.

Withdrawal Sign Control Mor Mor-NalCCK-8 Dev LY-288，513 Veh Diarrhea 0 0 1.0▲0.67 0.33 1.0 0.67 0.83 0.67 1.0 Teeth chattering 0 0 1.0▲ 0.67 0.63 0.33* 0.83 Ptosis 0 0 0.83▲ 0.33 0.67 0.17* 1.0 Chromodacryorrhea 0 0 0.67▲ 0.17 0.33 0.33 0.83 Abnormal posture0.17 0.17 1.0▲ 0.67 0.67 0.67 1.0 Genital grooming 0 0 0.83▲ 0* 0.33 0.17* 0.83 Irritability 0 0.17 1.0▲ 0.33*

Fig 1 Effects of CCK-8，devazepide and LY-288，513 on the Gellert-Holtzman score of the overall withdrawal severity(±s，n=6)

2.2 CCK-8對大鼠腦組織μ阿片受體結(jié)合反應(yīng)的影響 選取膜蛋白100 μg、［3H］-DAMGO 2 nmol·L－1、非標記配基 DAMGO 濃度 10 nmol·L－1作為結(jié)合反應(yīng)的條件，在反應(yīng)體系內(nèi)加入不同濃度(10－8～10－5mol·L－1)的CCK-8進行競爭結(jié)合抑制實驗，發(fā)現(xiàn)10－8～10－5mol·L－1CCK-8 可以劑量依賴性地抑制大鼠腦組織中μ阿片受體與配基的結(jié)合(P＜0.01，F(xiàn)ig 3)，并且此抑制作用可被CCK1及CCK2受體拮抗劑翻轉(zhuǎn)(P＜0.01，F(xiàn)ig 4);我們進一步用膜蛋白 100 μg、［3H］-DAMGO 0.5 ～8 nmol·L－15 個濃度點、非標記配基 DAMGO濃度10 nmol·L－1、4℃孵育過夜作為放射配基結(jié)合分析的條件(Fig 5)，測定了不同濃度的 CCK-8(10－10～ 10－6mol·L－1)對大鼠腦組織μ阿片受體的結(jié)合反應(yīng)的Bmax和Kd值的影響，發(fā)現(xiàn) CCK-8(10－8～10－6mol·L－1)可劑量依賴性的降低 μ阿片受體結(jié)合反應(yīng)的Bmax值(P ＜0.01，F(xiàn)ig 6)，而對 Kd值無影響(P ＞0.05，F(xiàn)ig 7)。

Fig 2 Effects of CCK-8，devazepide and LY-288，513 on the percentage of the weight loss(±s，n=6)

Fig 3 Effect of 10-8～10-5mol·L-1CCK-8 on binding of［3H］-DAMGO to μ-opioid receptor(±s，n=3)

Fig 4 Inhibitory effect of CCK-8(10-6mol·L-1)on binding of［3H］-DAMGO to μ-opioid receptor is blocked by CCK1 receptor antagonist devazepide and CCK2 receptor antagonist LY-288，513(±s，n=3)

Fig 5 Effect of CCK-8(10-6mol·L-1)on saturation curve of μopioid receptor binding assay.

Fig 6 Effect of 10-10 ～ 10-6mol·L-1CCK-8 on Bmaxof μ-opioid receptor(±s，n=3)

Fig 7 Effect of 10-10 ～ 10-6mol·L-1CCK-8 on Kdof μ-opioid receptor(±s，n=3)

3 討論

CCK-8是目前已知作用最強的內(nèi)源性“抗阿片肽”，并作為一種神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)制在中樞系統(tǒng)發(fā)揮著重要作用。本室以往研究發(fā)現(xiàn)給予嗎啡前外周腹腔注射CCK-8及CCK受體拮抗劑均可減輕慢性嗎啡依賴大鼠的戒斷癥狀，并可通過調(diào)節(jié)阿片受體［7］及其受體后Ca2+-CaM-CaMKⅡ信號通路發(fā)揮作用［8］，但是由于CCK-8不能通過血腦屏障，其外周和中樞機制可能并不一致，CCK-8的相關(guān)作用機制也不明確，所以本研究通過側(cè)腦室中樞給藥的方式進一步觀察了CCK-8及CCK受體拮抗劑對慢性嗎啡依賴大鼠的影響;并采用放射配基結(jié)合實驗，在體外觀察CCK-8對μ阿片受體結(jié)合反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，每次注射嗎啡前10 min側(cè)腦室給予CCK-8及CCK受體拮抗劑進行慢性干預(yù)，均可不同程度的減輕慢性嗎啡依賴大鼠的戒斷癥狀，可明顯緩解體重下降、腹瀉、跳躍、齒顫、流涎等癥狀。阿片受體是外源性阿片類物質(zhì)直接作用的靶點，在阿片類物質(zhì)濫用后造成一系列后效應(yīng)，使機體多個系統(tǒng)發(fā)生功能紊亂。放射配基結(jié)合實驗結(jié)果顯示，CCK-8可以抑制μ阿片受體與其配基的結(jié)合，并且此抑制作用可被CCK1及CCK2受體拮抗劑翻轉(zhuǎn);CCK-8劑量依賴性的降低了μ阿片受體結(jié)合反應(yīng)的Bmax值(受體結(jié)合容量)，而對 Kd值(受體親和力)無影響;說明CCK-8并非直接影響 μ阿片受體的結(jié)合，而是與CCK受體結(jié)合后，繼而與 μ阿片受體形成復(fù)合體，占據(jù)μ阿片受體的結(jié)合位點，降低受體結(jié)合容量，發(fā)揮其“抗阿片”效應(yīng)，CCK系統(tǒng)與阿片系統(tǒng)可通過受體水平的對話(cross talk)發(fā)生相互作用。

內(nèi)源性CCK對抗阿片物質(zhì)的作用可能是導(dǎo)致阿片類物質(zhì)耐受和成癮的機制之一，CCK可從受體及受體后水平拮抗阿片系統(tǒng)的功能，還可調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元的活動，并參與多巴胺調(diào)節(jié)的可卡因自身給藥模型、嗎啡條件位置性偏愛的表達、焦慮情緒等過程［11－12］，在成癮藥物引起的獎賞效應(yīng)中具有重要作用。因此，應(yīng)用CCK受體拮抗劑能逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受［9］、減輕嗎啡催促戒斷癥狀［10］。CCK-8 與 CCK1及CCK2受體均有較強的親和力，本研究發(fā)現(xiàn)外源性CCK-8慢性干預(yù)也可一定程度的減輕戒斷癥狀，與CCK受體拮抗劑的作用一致。我們考慮:CCK-8作用的量效關(guān)系成“U”型曲線，所以外源性大劑量CCK-8與內(nèi)源性CCK的作用可能相反;我們也證實了大劑量CCK-8本身反而使內(nèi)源性阿片肽水平增加，并可改善嗎啡依賴后內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的紊亂［13］。另外，外源性CCK干預(yù)與內(nèi)源性 CCK的分泌時相不一致，所以不同的給藥方式及時間也可能造成實驗結(jié)果的差異，注射嗎啡前給予CCK-8干預(yù)，可能拮抗了嗎啡的作用，發(fā)揮其“抗阿片”作用，進而影響外源性阿片物質(zhì)引起的腦功能紊亂，減輕戒斷癥狀。但是，阿片成癮涉及受體、神經(jīng)遞質(zhì)、細胞分子水平的調(diào)節(jié)等環(huán)節(jié)，是一種復(fù)雜的腦功能紊亂;在阿片成癮的不同過程中，其神經(jīng)機制并不一致，CCK-8在成癮各個環(huán)節(jié)的作用可能并不相同，在不同的實驗研究模型中也表現(xiàn)出不同的結(jié)果，外源性CCK-8對嗎啡成癮不同階段的作用及其相關(guān)機制還有待進一步明確。

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