CCL3L1基因拷貝數(shù)目變異與慢性乙肝的易感性相關(guān)*

鄭靈燕， 裴元元， 李淼新， 周 翔， 黃瑋俊， 丁紅珂， 王一鳴△

(1中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，廣東 廣州 510080;2香港大學(xué)精神病學(xué)系，腦與認(rèn)知科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó) 香港)

乙型病毒性肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染而引起的以肝臟損害為主要表現(xiàn)的關(guān)系到全球公共衛(wèi)生的重大疾病，尤其在發(fā)展中國(guó)家。我國(guó)是乙肝的高發(fā)國(guó)家，據(jù)衛(wèi)生部2006年的統(tǒng)計(jì)，我國(guó)人群中乙肝表面抗原 (hepatitis B surface antigen，HBsAg)的陽(yáng)性率為 7.18%(http://www.chinacdc.cn/n272442/n272530/n3479265/n3479303/37089.html)。

拷貝數(shù)目變異(copy number variations，CNVs)是近年來(lái)新揭示的一類基因組變異，含相應(yīng)基因組節(jié)段的缺失、重復(fù)及復(fù)雜重排等［1］，是疾病發(fā)生的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)。拷貝數(shù)目變異的基因組節(jié)段占整個(gè)人類基因組的12%［2］，覆蓋人類基因組中13%的基因及5%以上的編碼序列［3］?，F(xiàn)已證明拷貝數(shù)目的變異與精神分裂癥［4］、自閉癥［5］等疾病相關(guān)。

CCL3L1(chemokine CC motif ligand 3－like 1;RefSeq NM_02l006)基因編碼CCL3L1蛋白(UniProt ID∶P16619)。CCL3L1是一種強(qiáng)效的化學(xué)趨化性細(xì)胞因子，屬于趨化性因子β亞型(CC型)［6］。趨化性細(xì)胞因子是一類低分子量的多肽，其受體為7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員。趨化性細(xì)胞因子作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞分子，可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與免疫細(xì)胞分化發(fā)育、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等。科學(xué)家對(duì)57個(gè)不同人種的檢測(cè)表明，在各人種中CCL3L1基因均存在拷貝數(shù)目多態(tài)性，如其在白人中的中位數(shù)為2，而在非洲裔黑人中為6，這組學(xué)者檢測(cè)了45例中國(guó)漢族人群CCL3L1基因的拷貝數(shù)目，并報(bào)道我國(guó)漢族人群的中位數(shù)為4［7］。研究的新進(jìn)展表明，CCL3L1拷貝數(shù)目變異與艾滋病的易感性及疾病進(jìn)展、嚴(yán)重程度相關(guān)［7］，也與丙型病毒性肝炎的易感性相關(guān)［8］，2010年一項(xiàng)關(guān)于CCL3L1拷貝數(shù)目變異與靜脈吸毒者人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染相關(guān)關(guān)系的研究顯示HBV是一個(gè)協(xié)同因素，HBV血清學(xué)陽(yáng)性能提高HIV的感染率［9］。但還沒有CCL3L1拷貝數(shù)目變異與乙肝相關(guān)關(guān)系的報(bào)道。因此，我們采用大樣本量研究了我國(guó)漢族人群中CCL3L1拷貝數(shù)的分布情況，及其與慢性乙肝間的易感性關(guān)系，并初步探討可能的機(jī)制。

材料和方法

1 研究對(duì)象

收集2006年12月－2010年3月間在中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院感染科住院的慢性乙肝病人。慢性乙肝的診斷按中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)，肝病學(xué)分會(huì)標(biāo)準(zhǔn)［10］。入選者均排除了其它肝炎病毒的感染、人類免疫缺陷病毒的感染、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎、脂肪肝及妊娠期、正在接受抗結(jié)核藥物治療的病人、靜脈吸毒者、不同意加入本項(xiàng)研究者等。最終有1477例乙肝患者入選本項(xiàng)研究。

健康對(duì)照來(lái)自自愿參與本研究的知情同意者。入選條件為臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查證實(shí)為健康;所有健康對(duì)照均進(jìn)行了乙肝兩對(duì)半(HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb)及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)的檢測(cè)，且證實(shí)為非乙肝患者，也非乙肝病毒攜帶者。

2 方法

2.1 CCL3L1基因拷貝數(shù)目檢測(cè) 使用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI)，用Taqman探針進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)，檢測(cè)CCL3L1基因的拷貝數(shù)目。在絕對(duì)定量的模式下，選取A431細(xì)胞的DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品(已知A431細(xì)胞雙倍體基因組含2個(gè)拷貝的CCL3L1基因)，以2倍濃度差做梯度稀釋，每個(gè)濃度均重復(fù)3次，同時(shí)擴(kuò)增目的基因CCL3L1及內(nèi)參照基因β－globin構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。CCL3L1基因與管家基因β－globin的引物與探針序列如文獻(xiàn)報(bào)道［7］。每一板均做標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)檢測(cè)待測(cè)樣本的目的基因CCL3L1及內(nèi)參照基因β－globin，每個(gè)樣品均重復(fù)3次。利用ABISDS 1.4序列分析軟件，讀取每個(gè)樣品的初始模板量，同時(shí)計(jì)算每板結(jié)果的板間差異系數(shù)(板間差異系數(shù)為每一板中CCL3L1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線與 β－globin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比)。CCL3L1的拷貝數(shù)目等于CCL3L1的起始模板量與β－globin的起始模板量的比值，乘以板間差異系數(shù)，再乘以2。此檢測(cè)由2個(gè)獨(dú)立的研究者用雙盲法進(jìn)行。

2.2 CCL3L1拷貝數(shù)目與其mRNA、編碼蛋白CL3L1生成量及其趨化效力關(guān)系的研究 選取拷貝數(shù)為1(n=6)，拷貝數(shù)為2(n=6)，拷貝數(shù)為3(n=6)，拷貝數(shù)為4(n=6)，拷貝數(shù)為5(n=6)，拷貝數(shù)為6(n=6)，拷貝數(shù)為7(n=5)，拷貝數(shù)為8(n=5)的標(biāo)本(n表示標(biāo)本例數(shù))。

運(yùn)用qPCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)量。首先，用Trizol試劑盒(Invitrogen)提取總 RNA;然后用 Super-ScriptTMII RNase H逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng);最后，采用試劑盒2×Power SYBR Green Master Mix?(ABI)，在相對(duì)定量模式下，選取一個(gè)cDNA樣本2倍濃度差做梯度稀釋，擴(kuò)增目的基因CCL3L1及管家基因GAPDH構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用ΔΔCt法計(jì)算每個(gè)待測(cè)樣本的相對(duì)cDNA量。CCL3L1 cDNA，上游引物為 5'－TCTCTGCAACCAGGTCCTCTC －3'，下游引物為 5'－GGAGGTGTAGCTGAAGCAGCA－3'。GAPDH cDNA，上游引物為 5'－CAGAACATCATCCCTGCC －3'，下游引物為 5'－ GGTGCTAAGCAGTTGGTG －3'。

用Duoset ELISA development system(R＆D Systems)對(duì)蛋白產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。先將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋，用Fluorstar fluorescent plate reader(Tecan)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)待測(cè)樣本的A450，計(jì)算樣本的蛋白濃度。每個(gè)樣本檢測(cè)2次。

用Transwell法檢測(cè)不同拷貝數(shù)目的趨化效力［6］。構(gòu)建Transwell小室，每個(gè)外室孔內(nèi)加入10% 含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，PBS緩沖液可替代DMEM培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。用Calcein將活U973細(xì)胞染色，每個(gè)內(nèi)室小孔加入已染色的U973細(xì)胞約1×105。37℃、5%CO2孵育箱中孵育105 min后，用Fluorstar fluorescent plate reader(Tecan)檢測(cè)每個(gè)小孔的A490值，每個(gè)孔的A值減去陰性對(duì)照孔的A值后，計(jì)算相對(duì)趨化效力。

假定拷貝數(shù)目為1樣品的相對(duì)表達(dá)量及趨化效力為1，以此計(jì)算其它各組樣品的相對(duì)表達(dá)量以及趨化效力。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用中位數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，用Pearson's卡方檢驗(yàn)檢測(cè)CCL3L1基因拷貝數(shù)目變異與乙肝易感性的相關(guān)關(guān)系。運(yùn)用Logistic回歸校正性別與年齡后，進(jìn)一步分析CCL3L1與乙肝易感性的相關(guān)關(guān)系。

結(jié) 果

1 研究對(duì)象

表1顯示了病人組與正常對(duì)照組的基本臨床資料。收集1477例病人，男女比例為1093∶384。正常對(duì)照1023例，男女比例為508∶515。所有研究對(duì)象均為中國(guó)漢族人。

表1 病人與正常對(duì)照的基本臨床資料Table 1.Clinical data of patients and controls

2 我國(guó)漢族健康人及慢性乙肝患者CCL3L1拷貝數(shù)目的分布情況

對(duì)50例隨機(jī)人群進(jìn)行CCL3L1拷貝數(shù)目的檢測(cè)，結(jié)果顯示CCL3L1拷貝數(shù)目在我國(guó)漢族人群中呈常態(tài)分布，中位數(shù)為4，與美國(guó)學(xué)者報(bào)道的從45例中得到的數(shù)字相同。進(jìn)一步檢測(cè)1477例慢性乙肝病人及1023例健康對(duì)照的CCL3L1拷貝數(shù)目，結(jié)果病人和健康對(duì)照的中位數(shù)均為3，但在較為極端，即拷貝數(shù)目很低及很高的個(gè)體中，兩組的分布顯然有差異，見圖1。

3 CCL3L1拷貝數(shù)目與其mRNA、編碼蛋白CL3L1生成量及趨化效力相關(guān)關(guān)系

圖2顯示了CCL3L1拷貝數(shù)目與其mRNA、編碼蛋白CL3L1生成量及趨化效力相關(guān)關(guān)系。假定拷貝數(shù)目為1的樣品相對(duì)量為1，得到結(jié)果如下:CCL3L1 mRNA的表達(dá)量與CCL3L1基因拷貝數(shù)目呈正相關(guān)(R2=0.97)，CL3L1生成量與CCL3L1基因拷貝數(shù)目呈正相關(guān)(R2=0.97)，CCL3L1基因拷貝數(shù)目與其趨化效力呈正相關(guān)關(guān)系(R2=0.94)。隨著拷貝數(shù)目的增加，mRNA、編碼蛋白CL3L1的生成量及趨化效力也增加，見圖2。

Figure 2.Correlation between copy number of CCL3L1 and its mRNA，protein products and chemotactic effect.圖2 CCL3L1拷貝數(shù)目與其mRNA、CCL3L1蛋白生成量及趨化效力的相關(guān)關(guān)系

4 CCL3L1基因拷貝數(shù)與乙肝易感性的相關(guān)性

利用Pearson's卡方檢驗(yàn)，在自由度為9的情況下，P＜0.01，提示CCL3L1基因拷貝數(shù)與乙肝相關(guān)。運(yùn)用Logistic回歸校正性別與年齡后，CCL3L1拷貝數(shù)變異依然與乙肝具有相關(guān)性(P＜0.01)。

討 論

乙肝為多因素復(fù)雜性疾病，其易感性及感染后的轉(zhuǎn)歸受病毒載量，暴露時(shí)間，年齡，性別，父母患病狀況等因素的影響［11，12］。但正如 HIV 感染一樣，機(jī)體對(duì)乙肝病毒的免疫反應(yīng)及病毒在體內(nèi)的復(fù)制都受宿主遺傳因素的影響，故遺傳學(xué)因素在其易感性及疾病轉(zhuǎn)歸上起著重要作用［13］。在乙肝遺傳背景的研究中，HLA是最常被報(bào)道的基因［13］。

CCL3L1的拷貝數(shù)目分布在各人種中不同，我們大樣本量的CCL3L1拷貝數(shù)目分析獲得了比美國(guó)學(xué)者基于45例個(gè)體的結(jié)果更接近真實(shí)的分布特點(diǎn)，即在我國(guó)漢族人群CCL3L1基因拷貝數(shù)目的中位數(shù)為3，而非美國(guó)科學(xué)家報(bào)道的 4［7］。

CCL3L1是目前已知的存在拷貝數(shù)目變異的免疫基因之一［6，7］。Gonzalez 等［7］的研究發(fā)現(xiàn) CCL3L1拷貝數(shù)目變異與HIV/AIDS易感性相關(guān)，低拷貝數(shù)的個(gè)體感染HIV的風(fēng)險(xiǎn)升高。相反，曾有報(bào)道指出高CCL3L1拷貝數(shù)目的個(gè)體，患風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與川崎病的風(fēng)險(xiǎn)升高［14，15］。此外，Ptacek 等［16］和Mamtani等［17］分別報(bào)道CCL3L1拷貝數(shù)目變異與系統(tǒng)性紅斑狼瘡存在相關(guān)。2010年，德國(guó)科學(xué)家報(bào)道了CCL3L1拷貝數(shù)目變異與丙型病毒性肝炎(hepatitis C)的相關(guān)關(guān)系［8］。同一年，愛沙尼亞科學(xué)家對(duì)CCL3L1拷貝數(shù)目變異與靜脈吸毒者HIV的相關(guān)關(guān)系研究中，發(fā)現(xiàn)HBV血清學(xué)陽(yáng)性能提高HIV的感染率［9］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究CCL3L1基因拷貝數(shù)目多態(tài)性與乙肝易感性的相關(guān)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)漢族人群中，低CCL3L1基因拷貝數(shù)目是乙肝發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因素。

CCL3L1作為一種CC型強(qiáng)效的細(xì)胞因子，可通過(guò)與其受體(D6、CCR3、CCR5)的結(jié)合而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)［6］。其中CCR5為HIV進(jìn)入細(xì)胞的重要受體之一，有學(xué)者提出，高CCL3L1拷貝數(shù)目者之所以不易感染HIV，是由于其編碼的CCL3L1與CCR5結(jié)合，封閉了HIV進(jìn)入人體細(xì)胞的途徑。然而，HBV病毒進(jìn)入人體肝細(xì)胞的機(jī)制尚未明確，也沒有研究報(bào)道肝細(xì)胞上有上述受體表達(dá)。本研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR、ELISA和 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高拷貝CCL3L1能生成更多的mRNA、蛋白質(zhì)，并且對(duì)淋巴細(xì)胞具有更強(qiáng)的趨化性。因此高拷貝的CCL3L1基因?qū)BV的保護(hù)作用可能是讓機(jī)體生成更多的趨化因子CCL3L1，從而有助于免疫細(xì)胞發(fā)揮其保護(hù)作用。

由于我國(guó)目前還未有一套健全的乙肝疫苗注射登記系統(tǒng)，所以本研究在健康對(duì)照的篩選中未排除注射過(guò)乙肝疫苗者，故部分人的保護(hù)性作用可能來(lái)自于乙肝疫苗。這種在病例－對(duì)照研究中使用與病例組交叉的對(duì)照(overlapped control)已得到科學(xué)界的認(rèn)可，如英國(guó)多項(xiàng)由Wellcome Trust Sanger Institute進(jìn)行的相關(guān)關(guān)系研究均使用了生于1958年的對(duì)照(即58 birth cohort)，全然不計(jì)對(duì)照個(gè)體的患病狀態(tài)(http://www.wtccc.org.uk/)。由于本項(xiàng)目所采用的樣本量大，在這種情況下仍獲得了陽(yáng)性結(jié)果，這進(jìn)一步證實(shí)了CCL3L1基因拷貝數(shù)目變異與乙肝的相關(guān)關(guān)系?？偠灾?，本研究闡明了中國(guó)漢族人群中CCL3L1基因在健康人群中的分布情況及與乙肝易感的相關(guān)關(guān)系，低拷貝數(shù)目者更易患慢性乙肝，而高拷貝數(shù)目有保護(hù)性作用，并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。

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