Fractalkine對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細(xì)胞中NF－κB活化及內(nèi)源性fractalkine mRNA表達(dá)的影響*

郭興華， 潘云峰△， 宋澤蓉， 王 昆， 古潔若

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1風(fēng)濕免疫科，2骨科，廣東 廣州 510630)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜為主要靶組織的慢性系統(tǒng)性炎癥，影響世界上0.5% －1%的人群?；ぱ装Y細(xì)胞浸潤以及襯里層增生是其典型病理表現(xiàn)。增生的襯里層主要由巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fibroblast－like synoviocyte，F(xiàn)LS)組成。小分子炎癥介質(zhì)(花生四烯酸代謝產(chǎn)物)、生長因子、趨化因子、黏附因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等觸發(fā)滑膜細(xì)胞的增殖和活化，侵襲并損壞關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、肌腱和韌帶。因此，炎癥因子對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展都有重要的作用。而傳統(tǒng)的NF－κB通路在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥進(jìn)程中有重要地位。NF－κB是可誘導(dǎo)型二聚體轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，它擁有5個(gè)成分，分別是:Rel(c－Rel)、RelA(p65)、RelB、NF－κB1(p50/p105)和 NF－ κB2(p52/p100)。RA 發(fā)病中眾多細(xì)胞因子和細(xì)胞黏附分子被激活受到NF－κB的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［1］。同時(shí)，RA滑膜表達(dá)的許多炎癥介質(zhì)又可作用于NF－κB使其活化，如TNF－α和IL－1β［2］，兩者構(gòu)成一反饋機(jī)制，導(dǎo)致 RA 炎癥反應(yīng)和結(jié)構(gòu)破壞得以維持與發(fā)展。

Fractalkine(FKN)，又稱 CX3CL1，是 CX3C類趨化因子中的唯一成員，由373個(gè)氨基酸組成的大分子蛋白。CX3CR1是FKN的高親和力受體，屬于趨化因子受體超家族成員。Chandrasekar等［3］在動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KN可通過NF－κB誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的增殖。RA－FLS可分泌游離的FKN［4］，但FKN對(duì)RA－FLS NF－κB活化及內(nèi)源性FKN的表達(dá)有無影響，尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究觀察FKN刺激RA－FLS后，對(duì)細(xì)胞中NF－κB活化以及內(nèi)源性FKN mRNA表達(dá)的影響，以期了解FKN對(duì)RA中NF－κB活化以及炎癥維持和發(fā)展的影響。

材料和方法

1 標(biāo)本采集

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織來自2009年3月－2009年8月中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院行關(guān)節(jié)置換術(shù)，共3例，均取自髖關(guān)節(jié)。年齡24－50，平均36.3歲，病程8－9年，平均102個(gè)月。所有RA患者診斷符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American Rheumatism Association，ARA)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)。

2 主要試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自杭州四季青公司;重組人fractalkine(CX3CL1/FKN)購自PeproTech;培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取試劑盒、含裂解液、去蛋白液、漂洗液、DEPC處理水、吸附柱、過濾柱、離心管(1.5 mL)和收集管(2 mL)購自北京天根生化科技有限公司;Fermentas RevertAid第1鏈cDNA合成試劑盒、含DEPC處理水、Oligo(dT)18引物(0.5 g/L)、5×反應(yīng)緩沖液，Ribolock RNA酶抑制劑(20 g/L)、dNTP混合物和ReverAid M－MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(2×108U/L)購自 Fermentas;2×Taq Plus PCR Master Mix(預(yù)染)購自北京天根生化科技有限公司;DNA marker 1購自北京天根生化科技有限公司;引物由廣州英駿生物技術(shù)有限公司合成;核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;靶Ⅰ抗:兔抗人抗NF－κB p65單克隆抗體(C22B4)購自Cell Signaling;小鼠抗人抗TATA結(jié)合蛋白(TATA －binding protein，TBP)單克隆抗體(MAB3658)購自Millipore;兔抗人抗磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體購自廣州藝佳生物;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記Ⅱ抗購自武漢博士德。

3 方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 滑膜組織經(jīng)無菌條件下處理后，向滑膜組織滴加1－2滴20%FBS培養(yǎng)液，將其銳性剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm大小，將組織塊移至培養(yǎng)瓶中，均勻擺放到瓶底，將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使組織塊面位于上方，加入適量20%FBS培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中約5 h。將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，使組織塊浸沒于培養(yǎng)液中，避免將組織塊沖起。置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的生長情況及培養(yǎng)液的變化，每1－3 d更換培養(yǎng)液1次。當(dāng)細(xì)胞生長至覆蓋底面＞80%時(shí)，可進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。經(jīng)消化傳代后獲得較純成纖維樣滑膜細(xì)胞［5］。本實(shí)驗(yàn)均使用第3代滑膜細(xì)胞。

3.2 NF－κB活化檢測(cè) RA－FLS中加入100 μg/L FKN，分別作用0 h、1 h、2 h后收集細(xì)胞，用核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒提取胞核及胞漿蛋白，用Western blotting檢測(cè)其胞漿及胞核中NF－κB p65蛋白表達(dá)的變化，即取25 μg蛋白(胞核或胞漿蛋白)，經(jīng)10%SDS－PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)印到PVDF膜，取膜于5%封閉液中封閉，恒溫?fù)u床搖2 h;洗膜5次后，加入Ⅰ抗(NF － κB p651∶300，TBP 1∶500，GAPDH 1∶500，取抗體稀釋液稀釋)，反應(yīng)1 h，洗膜5次，每次間隔5 min，加HRP標(biāo)記Ⅱ抗(1∶1000，取抗體稀釋液稀釋)，反應(yīng)1 h，洗膜5次，每次間隔5 min，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)化學(xué)發(fā)光液，3－5 min后于暗室顯影后沖洗膠片。用Quantity One軟件進(jìn)行分析，讀取吸光度值(absorbance，A)，計(jì)算各樣本胞漿和胞核中NF－κB p65與胞漿內(nèi)參(GAPDH)和胞核內(nèi)參(TBP)的吸光度比值，作為樣本的相對(duì)吸光度值，以觀察各樣本胞漿及胞核中NF－κB p65蛋白表達(dá)量的變化。

3.3 RT－PCR檢測(cè)RA－FLS中FKN mRNA表達(dá)RA －FLS中加入100 μg/L FKN，分別作用0 h、12 h及18 h后收集細(xì)胞，用培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取試劑盒提取總RNA，用Fermentas RevertAid第1鏈cDNA合成試劑盒合成 cDNA，即總 RNA 11 μL和 Oligo(dT)181 μg，70 ℃ 反應(yīng) 5 min，再加 5 × 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL、RiboLock RNase Inhibitor 1 μL、dNTP Mix(各10 mmol/L)2 μL，37 ℃ 反應(yīng) 5 min，再加 RevertAid M －MuLV RT 1 μL，42 ℃反應(yīng)60 min，最后 70 ℃反應(yīng)10 min，產(chǎn)物用作PCR。用2×Taq Plus PCR Master Mix(預(yù)染)行PCR，引物為:CX3CL1正義鏈5’－TACCTGTAGCTTTGCTCATCCA－3’，反義鏈 5’－ACCACAGACTCGTCCATTCC－3’，產(chǎn)物長度為250 bp;β－actin正義鏈 5’－ CGGGACCTGACTGACTACCTC－3’，反義鏈 5’－ACTCGTCATACTCCTGCTTGC－3’，產(chǎn)物長度為547 bp。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，含RT 產(chǎn)物1 μL ，2 ×Taq Plus PCR Master Mix10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序:95℃ 5 min后，95℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃15 s，35個(gè)循環(huán)后再72℃ 8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于含溴化乙啶瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。以目的條帶與βactin的電泳條帶的吸光度值比值作為mRNA的相對(duì)表達(dá)量并與對(duì)照組比較。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，各組間總差異比較用單因素方差分析，兩組間差異比較采用LSD法。

結(jié) 果

1 重組人FKN對(duì)RA－FLS NF－κB活化的影響

結(jié)果顯示，F(xiàn)KN刺激后1 h后胞漿中NF－κB p65蛋白表達(dá)量較對(duì)照組(0 h)降低(P＜0.05)，見圖1。2 h后胞核中NF－κB p65蛋白表達(dá)量較對(duì)照組(0 h)升高(P＜0.05)，見圖2，提示FKN對(duì)RAFLS中NF－κB有激活作用。

2 重組人FKN對(duì)RA－FLS中FKN mRNA表達(dá)的影響

RA－FLS中加入100 μg/L重組人FKN分別作用0 h、12 h、18 h，圖3 顯示刺激18 h后 FKN mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組(0 h)(P＜0.05)，提示在0－18 h范圍內(nèi)，隨著時(shí)間延長，F(xiàn)KN促進(jìn)RA－FLS內(nèi)源性FKN mRNA表達(dá)增加。

討 論

Figure 1.Effect of FKN on NF－ κB activity in RA －FLS cytoplasm.NF－κB p65 protein of cytoplasm was detected by Western blotting 0 h，1 h and 2 h after treatment with 100 μg/L FKN..n=3.*P ＜0.05 vs 0 h group.圖1 FKN對(duì)RA－FLS胞漿中NF－κB的作用

Figure 2.Effect of FKN on NF－κB activity in RA －FLS nucleus.NF － κB p65 protein in nucleus was examined by Western blotting.0 h，1 h and 2 h after 100 μg/L FKN treatment..n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 h group.圖2 FKN對(duì)RA－FLS胞核中NF－κB的作用

Figure 3.Effect of FKN on the expression of FKN mRNA.RAFLS were stimulated with 100 μg/L FKN，and FKN mRNA expression was detected by RT－PCR at different time points.M:DNA marker 1..n=3.*P＜0.05 vs 0 h group.圖3 FKN對(duì)RA－FLS中FKN mRNA表達(dá)的影響

NF－κB是一種廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)許多炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生并導(dǎo)致疾病進(jìn)展［6］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用了NF－κB活化后從胞漿轉(zhuǎn)移胞核的原理，檢測(cè)胞漿和胞核內(nèi)p65蛋白表達(dá)的變化，以證明NF－κB通路是否被活化。實(shí)驗(yàn)中顯示，當(dāng)加入100 μg/L FKN 1 h后，胞漿中的p65蛋白即減少，而2 h后胞核中的NF－κB p65蛋白上升，提示當(dāng)加入FKN后1h NF－κB p65開始轉(zhuǎn)移至胞核，2 h后可檢測(cè)出胞核內(nèi)p65蛋白上升，即FKN可激活NF－κB通路。在類風(fēng)濕滑膜中有豐富的NF－κB，免疫組化分析證實(shí)在滑膜襯里層的細(xì)胞核中存在p50和p65表達(dá)量比較豐富，尤其是 p65的表達(dá)［7］。NF－κB參與了RA炎癥中許多細(xì)胞因子的表達(dá)，在與RA有密切關(guān)系的基因的表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如單核細(xì)胞中的IL－1β、滑膜細(xì)胞中的 ICAM －1、TNF－α、IL－6和IL－8。同時(shí)滑膜細(xì)胞還產(chǎn)生許多酶，這些酶可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞軟骨和骨質(zhì)。NF－κB抑制劑可抑制人巨噬細(xì)胞和初期RA滑膜細(xì)胞這些破壞性酶(如金屬蛋白酶、蛋白聚糖酶)和炎癥因子(如IL－1β、IL－6、IL－8和 TNF－α)的產(chǎn)生，提示 NF－κB是這些酶和炎癥因子合成的基礎(chǔ)因素［8］。因此，F(xiàn)KN對(duì)NF－κB的活化可促進(jìn)炎癥發(fā)展、軟骨和骨質(zhì)的破壞。

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入外源的FKN刺激RA－FLS 18 h后，可表現(xiàn)出其促進(jìn)內(nèi)源性FKN mRNA表達(dá)的作用，提示RA－FLS中可能存在FKN正反饋現(xiàn)象。在RA患者關(guān)節(jié)中存在各種各樣的炎癥因子，部分還可提升FKN表達(dá)，起到放大作用，如IFNγ和TNF－α［9］。FKN的這種正反饋?zhàn)饔眉捌渌装Y因子的放大作用可導(dǎo)致RA關(guān)節(jié)內(nèi)FKN大量聚集。FKN有黏附、趨化、促進(jìn)細(xì)胞滲出的作用，因此其大量聚集可影響前炎癥細(xì)胞在關(guān)節(jié)內(nèi)浸潤和導(dǎo)致CX3CR1+細(xì)胞聚集。表達(dá) CX3CR1的細(xì)胞包括Th1、Tc1、γδT、NK 細(xì)胞、大部分 CD16+NK 細(xì)胞、多數(shù)的CD14+單核細(xì)胞和部分的CD3+T細(xì)胞。Th1和Tc1細(xì)胞可分泌IFN－γ、TNF－β和IL－2，介導(dǎo)針對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗原的免疫反應(yīng)和器官特異性的自身免疫反應(yīng)。γδT細(xì)胞和 NK細(xì)胞可表達(dá) CD57、CD11b(細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞的有效標(biāo)志)和分泌穿孔素和粒酶B。這些提示CX3CR1+細(xì)胞是高選擇性的趨化細(xì)胞毒作用的淋巴細(xì)胞(包括NK細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和γδT細(xì)胞)［10］。這致使大量細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞在關(guān)節(jié)內(nèi)聚集，炎癥進(jìn)一步擴(kuò)大。

除了介導(dǎo)遷移，F(xiàn)KN和CX3CR1還可增強(qiáng)炎癥細(xì)胞的破壞能力。游離FKN可誘導(dǎo)NK細(xì)胞滲出和增強(qiáng)其脫顆粒和溶解細(xì)胞的作用，表達(dá)CX3CR1的CD8+T細(xì)胞具有更強(qiáng)大的細(xì)胞毒作用［10］。Yoneda等［11］報(bào)道，用固化的FKN刺激NK細(xì)胞，或用表達(dá)FKN的細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)，可明顯上調(diào)IFN－γ。Nanki等［12］報(bào)道表達(dá) CX3CR1的 CD4+和 CD8+T 細(xì)胞在RA患者中增多，這些T細(xì)胞都產(chǎn)生IFN－γ和TNF－α。IFN－γ又可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中FKN的表達(dá)［13］，這樣一個(gè)旁分泌正反饋循環(huán)，導(dǎo)致RA關(guān)節(jié)中FKN進(jìn)一步積聚，繼而趨化更多細(xì)胞毒作用的淋巴細(xì)胞遷移至關(guān)節(jié)中，并且這些淋巴細(xì)胞的作用被加強(qiáng)，最終可能加重RA關(guān)節(jié)中炎癥程度和關(guān)節(jié)的破壞。

在RA滑膜中，CX3CR1可在巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中表達(dá)。這提示FKN還可能對(duì)這些細(xì)胞產(chǎn)生生物效應(yīng)。CD68+CD16+［14］和CD14+CD16+單核細(xì)胞表達(dá)CX3CR1，細(xì)胞通過CD16與CX3CR1相互作用聚集在滑膜襯里層及滑膜下層中。CD14+CD16+單核細(xì)胞表達(dá)一些特殊類型的表面分子，而且可產(chǎn)生TNF－α、IL－1β和IL－6，低表達(dá)或不表達(dá)抗炎因子IL－8，因此這群細(xì)胞可迅速地遷移至炎癥部位，迅速成熟為促炎癥巨噬細(xì)胞。游離FKN還可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌IL－1β和IL－6［15］?；褐蠧D14+單核細(xì)胞表達(dá)FKN和CD3+T細(xì)胞表達(dá)CX3CR1分別與晨僵和腫脹關(guān)節(jié)數(shù)有關(guān)［15］。Volin等［16］發(fā)現(xiàn) pmol/L 及 nmol/L 級(jí)的游離FKN對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞均有趨化和激動(dòng)的作用，可誘導(dǎo)更多內(nèi)皮小管形成，將固化有FKN的基質(zhì)膠移植到小鼠中，可見新血管形成。FKN還可促進(jìn)MMP的分泌，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨的破壞［17］。

進(jìn)入核內(nèi)的NF－κB識(shí)別共同的DNA序列，調(diào)節(jié)一系列靶基因，特別是參與人體免疫系統(tǒng)和抵御病原體的基因的表達(dá)，包括許多細(xì)胞黏附分子、趨化因子及急性反應(yīng)蛋白等［3］。RA發(fā)病中眾多細(xì)胞因子和細(xì)胞黏附分子受到NF－κB的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如細(xì)胞因子(如 TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－2、IL－12、IFN － γ、GM －CSF、EGF［18］)、細(xì)胞黏附分子(如選擇蛋白、VCAM －1、ICAM －1)，化學(xué)增活素(如 IL－8、MIP－1α、MCP －1、RANTES、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP－1、MMP－3、MMP－13)、受體(如 MHC)和誘導(dǎo)酶(如 COX－1、iNOS)［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示 RA－FLS中可能存在FKN正反饋現(xiàn)象，F(xiàn)KN對(duì)NF－κB有活化作用。在平滑肌細(xì)胞中，NF－κB的活化可增加 FKN的表達(dá)［3］。在 RA －FLS中，NF－κB的活化是否增加FKN的表達(dá)，F(xiàn)KN基因啟動(dòng)子中是否存在NF－κB的結(jié)合位點(diǎn)，有待后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

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