痛風(fēng)患者CXCL16血清水平的變化及臨床意義*

吳 帆， 龔 琦， 俞佳文， 盧婷婷， 李校堃， 林灼鋒△

(1中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心，廣東 廣州 510665;2溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，浙江 溫州 325035)

痛風(fēng)是一種由尿酸鹽晶體沉積在關(guān)節(jié)和其它組織所引發(fā)的常見的炎癥關(guān)節(jié)炎。在關(guān)節(jié)處的尿酸鹽結(jié)晶沉積物能引起嚴(yán)重的炎癥應(yīng)答。這種炎癥應(yīng)答是由帶負(fù)電荷的晶體表面活化補(bǔ)體引發(fā)的。補(bǔ)體活化促進(jìn)炎細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素8(interleukin 8，IL－8)、C-X-C趨化因子配體8(CXC chemokine ligand 8，CXCL8)、CXCL18 等的產(chǎn)生［1，2］。CXCL16是趨化因子家族中的一員，對(duì)白細(xì)胞表達(dá)的C-X-C趨化因子受體6(CXCR6)有趨向特性［3］。與其它所有的趨化因子相比，CXCL16和曲動(dòng)蛋白較為相似，由跨膜蛋白和可溶的趨化物組成，表達(dá)于巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和腎小囊臟層細(xì)胞的表面［4］。最近研究發(fā)現(xiàn):CXCL16在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織(rheumatoid arthritis synovial tissue，RAST)中高度表達(dá)，同時(shí)介導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cell，MNC)積聚于關(guān)節(jié)滑膜組織［4］;抑制CXCL16的生物活性能顯著改善膠原誘發(fā)的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病變狀況。這表明CXCL16在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制上起著重要作用，是一個(gè)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在生物靶點(diǎn)［5］。與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的功能相似，在痛風(fēng)的模型中，CXCL16作為重要的介質(zhì)促使白細(xì)胞堆積于關(guān)節(jié)滑膜組織［6］。這表明CXCL16在痛風(fēng)的發(fā)病過程中也扮演著重要的角色，但痛風(fēng)患者血清CXCL16水平變化及臨床價(jià)值依然未明。本研究采用病例對(duì)照的方法，觀察痛風(fēng)患者血清CXCL16水平及其臨床意義。

材料和方法

1 臨床資料

研究對(duì)象為2009年7月－2010年2月入住溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院南浦院區(qū)腎內(nèi)科的20例痛風(fēng)并有慢性腎病患者、22例年齡性別相匹配的慢性腎病患者以及22例無其它并發(fā)癥的痛風(fēng)患者。痛風(fēng)患者的入選嚴(yán)格按美國大學(xué)風(fēng)濕病學(xué)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟推薦的痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行［8］。同時(shí)在正常體檢人群中隨機(jī)抽取20個(gè)作為對(duì)照人群。

2 血清CXCL16水平測定

用采血管取晨空腹靜脈血，3000 r/min離心5 min，分離上層血清，置于－80℃冰箱待用。采用酶聯(lián)免疫法測定CXCL16的水平。操作程序嚴(yán)格按照試劑盒說明書，該試劑盒購自R＆D。

3 單個(gè)核細(xì)胞RNA提取及實(shí)時(shí)定量PCR檢測

采用Trizol(Invitrogen)試劑盒分別從慢性腎病患者、痛風(fēng)患者、正常人的新鮮外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中分離出RNA，并采用Promega生產(chǎn)的cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。我們使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀(ABI生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，以SYBR Green定量分析試劑擴(kuò)增檢測目標(biāo)基因在患者和正常對(duì)照人群中的表達(dá)差異，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，總反應(yīng)體積為20 μL，并以下參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)展反應(yīng):50℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。CXCL16引物序列分別為:正義鏈 5'－CGTCACTGGAAGTTGTTATTG －3'，反義鏈 5'－ACACCGATGGTAAGCTCTC －3'。

4 其他臨床相關(guān)指檢測

各臨床指標(biāo)按臨床實(shí)驗(yàn)室的檢測標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，其中包括:體重指數(shù)(body mass index，BMI)、舒張壓(diastolic pressure)、肌酐清除率(creatinine clearance rate，CCR)、估計(jì)腎小球?yàn)V過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)、C 反應(yīng)蛋白(C －reactive protein，CRP)、24 h 尿蛋白(24 h urine protein)、血總蛋白(blood total protein)、血白蛋白(blood albulimin)、空腹血糖(fasting glucose)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(creatinine)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)、血紅蛋白(hemoglobin)和血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，兩組數(shù)據(jù)之間采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間采用One－way ANOVA和多元逐步回歸分析。

結(jié) 果

1 痛風(fēng)患者的血漿CXCL16水平顯著升高

圖1A所示，痛風(fēng)患者的血清 CXCL16水平［(2.68±0.09)μg/L］顯著高于正常研究對(duì)象人群［(1.56±0.06)μg/L］，也高于年齡性別相匹配的慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)患者［(2.40 ±0.08)μg/L］，但明顯低于痛風(fēng)并伴有CKD的患者［(3.24±0.23)μg/L］(P ＜0.05)。圖1B 所示，在痛風(fēng)患者外周單個(gè)核細(xì)胞中，CXCL16 mRNA表達(dá)水平比健康的研究對(duì)象水平顯著升高(P＜0.05)，但與年齡性別相匹配的慢性腎病患者相比，兩者不存在顯著差異;此外，在未伴有其它并發(fā)癥的痛風(fēng)患者與伴有CKD的痛風(fēng)患者中，兩者的外周血單核細(xì)胞CX- CL16 mRNA水平也無顯著差異。

Figure 1.Changes of serum CXCL16 level(A)and CXCL16 mRNA expression(B)in gout，chronic kidney disease(CKD)and normal subjects..A:n=20－22;B:n=8.*P＜0.05 vs normal group;△P＜0.05 vs CKD group;#P＜0.05 vs gout group.圖1 CXCL16表達(dá)水平在痛風(fēng)、CKD及正常人群的表達(dá)狀況

2 痛風(fēng)患者中并發(fā)癥對(duì)血清CXCL16的影響

痛風(fēng)伴有2型糖尿病患者的CXCL16水平［(3.17 ±0.71)μg/L，n=12］顯著高于不伴有2型糖尿病患者的痛風(fēng)患者［(2.09±0.11)μg/L，n=14，P＜0.05，見圖2A］;痛風(fēng)伴有高血壓患者的血漿CXCL16水平顯著高于痛風(fēng)無高血壓癥狀的患者［(2.97 ± 0.44)μg/L vs(1.95 ± 0.09)μg/L，P＜0.05，見圖2B］;同時(shí)伴有糖尿病和高血壓的痛風(fēng)患者的血漿CXCL16水平［(2.65 ±0.45)μg/L，n=8］與未伴有這兩種并發(fā)癥的痛風(fēng)患者［(1.88±0.10)μg/L，n=8］相比較，前者也顯著高于后者(P＜0.05)，見圖2C。

Figure 2.The effects of diabetes mellitus(DM)and hypertension(H)on serum CXCL16 level in gout patients..n=8－14.*P＜0.05 vs gout without DM;△P＜0.05 vs gout without H;#P＜0.05 vs gout without DH.DH:diabetes mellitus and hypertension.圖2 痛風(fēng)并發(fā)癥對(duì)痛風(fēng)患者血清CXCL16水平的影響

3 血清CXCL16與臨床指標(biāo)之間的關(guān)系

表1和圖3顯示，在痛風(fēng)患者中血清CXCL16水平與eGFR和內(nèi)源性CCR呈負(fù)相關(guān)，與血肌酐和BUN呈正相關(guān)，這些表明上升了的CXCL16濃度與腎臟功能有密切關(guān)系。此外，在痛風(fēng)患者和正常研究對(duì)象(表1)中調(diào)整了BMI、年齡、性別、高血壓和糖尿病等因素后，血清CXCL16水平與收縮壓、舒張壓、CRP、脂聯(lián)素、空腹血糖值、尿酸、24 h尿蛋白、PTH和血清磷酸鹽呈正相關(guān)(P＜0.05)。

4 CXCL16水平與24 h尿蛋白、CCR和CRP的相關(guān)性研究

經(jīng)年齡、性別、BMI、T2DM和高血壓等因素校正后，痛風(fēng)患者的CXCL16水平與24 h尿蛋白、CCR和CRP 3個(gè)因素獨(dú)立相關(guān)(P＜0.05)，見表2。

討 論

本研究目的是觀察CXCL16在痛風(fēng)患者生理和病理?xiàng)l件下的臨床特征。我們的結(jié)果表明:在痛風(fēng)并有慢性腎病患者中，其血漿CXCL16水平顯著高于正常對(duì)照人群以及年齡性別相匹配的慢性腎病患者;在痛風(fēng)患者中，相關(guān)的并發(fā)癥如DM、高血壓等影響血清CXCL16水平;在痛風(fēng)患者中，CXCL16與患者的腎功能密切相關(guān)。這些結(jié)果提示CXCL16在痛風(fēng)的發(fā)病過程中扮演著重要的角色。

表1 CXCL16與痛風(fēng)患者臨床指標(biāo)之間的關(guān)系Table 1.The relationship between serum CXCL16 level and clinical indexes in patients with gout

表2 與CXCL16獨(dú)立相關(guān)的幾個(gè)因素Table 2.Several parameters independently associated with CXCL16 in gout patients

CXCL16是一種在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和腎小囊臟層細(xì)胞的表面表達(dá)的趨化因子［4，5，9］，同時(shí)發(fā)現(xiàn)它在 RAST 中高度表達(dá)，且MNC聚集于RAST［6］。此外，早期的研究發(fā)現(xiàn):活動(dòng)期痛風(fēng)患者單核細(xì)胞表面CXCL16的表達(dá)與正常對(duì)照人群比較處較低的表達(dá)水平;但痛風(fēng)患者的PBMC CXCL16 mRNA水平與健康對(duì)照組相當(dāng)［10］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn):痛風(fēng)患者伴有CKD的循環(huán)CXCL16水平顯著高于正常對(duì)照人群以及年齡性別相匹配的CKD患者;此外，痛風(fēng)患者中取出的新鮮PBMC CXCL16 mRNA水平與健康對(duì)照組相比較，前者顯著高于后者。這些結(jié)果提示:CXCL16在痛風(fēng)發(fā)病過程中可能扮演著不同的角色。

Figure 3.Correlation of serum CXCL16 level with eGFR(A)，CCR(B)，creatinine(C)and BUN(D)in gout and normal subjects.圖3 血清CXCL16水平與eGFR、CCR、血肌酐和BUN相關(guān)

除了作為趨化因子配體，CXCL16(又稱SRPSOX)以跨膜蛋白的形式作為氧化型低密度脂蛋白(oxidized low －density lipoprotein，oxLDL)的清道夫受體。早期的研究發(fā)現(xiàn):高代謝壓力條件下，如鏈脲霉素導(dǎo)致的糖尿病小鼠模型［11］、糖尿病伴有冠狀動(dòng)脈疾病和冠心病患者中均出現(xiàn)高血清oxLDL水平［12，13］。痛風(fēng)是一種由尿酸鹽晶體沉積在關(guān)節(jié)和其它組織所引發(fā)的的常見的炎癥關(guān)節(jié)炎，也是機(jī)體代謝失衡所引發(fā)的一種疾病。我們前期研究表明:在CKD患者中循環(huán)CXCL16水平比起正常研究對(duì)象水平顯著上升。而本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)了在痛風(fēng)并伴有CKD患者的循環(huán)CXCL16水平顯著高于年齡、性別、eGFR匹配的CKD患者(圖1A)。這說明CXCL16在痛風(fēng)發(fā)病過程中扮演著重要的角色，而它是否與機(jī)體代謝失衡所引發(fā)的高oxLDL相關(guān)，需要進(jìn)一步的研究。

eGFR、CCR、血肌酐和BUN都是傳統(tǒng)的生物標(biāo)志，它們反應(yīng)腎小球功能的改變［14］。本研究中，我們的數(shù)據(jù)顯示:在痛風(fēng)患者中血清CXCL16水平與eGFR、CCR、血肌酐和BUN高度相關(guān)(圖3)，這表明痛風(fēng)患者中高濃度的CXCL16與腎小球受損和腎小球功能改變有著密切關(guān)系。然而，有關(guān)痛風(fēng)發(fā)病過程中CXCL16濃度升高的具體機(jī)制依然未能明了。我們推測:CXCL16在痛風(fēng)中的升高是一種應(yīng)激反應(yīng)，由新陳代謝變化所引起。由于CXCL16水平的改變也在其它代謝性疾病如冠心病、腎衰竭等中發(fā)現(xiàn)，這需要進(jìn)一步研究來闡明CXCL16在痛風(fēng)發(fā)病中所扮演的角色。

本項(xiàng)目研究還存在幾個(gè)局限:(1)患者及對(duì)照人群的樣本量相對(duì)較少;(2)作為臨床研究，其本身未能闡明CXCL16和痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制的因果關(guān)系。因此，加大樣品量，進(jìn)一步探索CXCL16與痛風(fēng)發(fā)病之間的關(guān)系也是本項(xiàng)目必須深入的首要任務(wù)之一。

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