白血病Reh、HL－60、K562細(xì)胞系RUNX3基因P2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與RUNX3基因表達(dá)*

李大彩， 吳明彩， 張根葆， 畢富勇△

(皖南醫(yī)學(xué)院1腫瘤生化研究室，2病理生理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

白血病是一種造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康。隨著近年來分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，白血病的治療水平有了很大提高，比如急性早幼粒細(xì)胞白血?。?］，但這僅是少數(shù)特例。另外很多類型的白血病治療效果仍然不佳，預(yù)后差。RUNX3屬人runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runtrelated transcription factor，RUNX)家族成員，RUNX3基因作為一種近年來發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，已在多種實(shí)體瘤中發(fā)現(xiàn)其發(fā)生了異常甲基化，并且認(rèn)為RUNX3基因啟動(dòng)子的甲基化是導(dǎo)致該基因失活，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。而該基因啟動(dòng)子在不同白血病細(xì)胞中的甲基化狀態(tài)的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用甲基化特異性 PCR(methylation－specific PCR，MSP)和RT－PCR方法對白血病Reh、HL－60和K562細(xì)胞系進(jìn)行研究，探討白血病 Reh、HL－60和 K562細(xì)胞系中RUNX3基因P2啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)及該基因的表達(dá)情況。

材料和方法

1 材料

1.1 主要儀器與試劑 PCR擴(kuò)增儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司);水平電泳槽、電泳儀(北京六一儀器公司);捷達(dá)801凝膠成像系統(tǒng)(江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)。DNA提取試劑盒(Promega);Epitect Bisulfite Kit(Qiagen);Trizol試劑(上海生工);PCR試劑盒(Promega);RT－PCR(Promega);RPMI－1640(上海生工);胎牛血清(Biochrom/上海生工);DNA marker(上海生工);瓊脂糖(西班牙進(jìn)口);DNase 1(上海生工)。引物［2］委托上海生工合成，見表1。

表1 引物、序列及擴(kuò)增長度Table 1.The primer sequence and amplification length

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人白血病細(xì)胞系Reh購自中科院上海細(xì)胞庫(ATCC建系)，人白血病細(xì)胞系HL－60和K562由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。Reh、HL－60、K562細(xì)胞于RPMI－1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，其中Reh細(xì)胞系的培養(yǎng)血清為Biochrom胎牛血清，余為上海生工胎牛血清)，37℃、5%CO2、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中孵育，2－3 d傳代1次。以對數(shù)生長期的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

2 方法

2.1 DNA提取及MSP 取1×106細(xì)胞按DNA提取說明書(Promega)提取DNA，對提取的DNA用紫外分光光度計(jì)檢測其純度及含量，DNA純度測定:A260/A280＞1.8。取2 μg DNA按Epitect Bisulfite Kit(Qiagen)說明書進(jìn)行修飾及純化，純化后的DNA立即使用或－20℃保存?zhèn)溆谩＜兓蟮腄NA作為模板進(jìn)行MSP，PCR反應(yīng)體系(25 μL):2× GoTaq? Hot Start Green Master Mix 12.5 μL，Epitect Bisulfite Kit修飾后的DNA 模板 2 μL，雙蒸水 8.5 μL，引物(10 umol/L)各 1 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min后進(jìn)行35個(gè)循環(huán):94℃30 s，58℃ 30s，72℃ 30 s，最后1個(gè)循環(huán)后再72℃ 5min。每個(gè)樣本擴(kuò)增時(shí)，同時(shí)以滅菌雙蒸水作為陰性對照。取5 μL PCR產(chǎn)物3.5%的瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶)電泳，分析產(chǎn)物。

2.2 RNA提取及RT－PCR 取1×106細(xì)胞用 Trizol試劑(上海生工)按說明書提取RNA。用DNase1(RNA free)(上海生工)消化RNA中痕量的DNA，用紫外分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的含量及純度。RNA的純度測定:A260/A280＞2.0。取消化后的RNA作為模板進(jìn)行RT－PCR實(shí)驗(yàn)，操作按試劑盒說明書(Promega)一步法進(jìn)行。RT－PCR體系為 25 μL，2 × AccessQuickTMMaster Mix 12.5 μL，RNA 模板 2 μL，Nuclease － free water 6.5 μL，引物各 2 μL，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL。RT－PCR反應(yīng)條件為:45℃孵育45 min，95℃預(yù)變性2 min之后進(jìn)行32個(gè)如下循環(huán):95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，最后1個(gè)循環(huán)后再72℃ 5 min。同時(shí)，滅菌DEPC水作為陰性對照，GAPDH作為內(nèi)參照。擴(kuò)增產(chǎn)物3.5%的瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶)電泳，分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析 用凝膠成像系統(tǒng)(捷達(dá)801)掃描電泳條帶，以RUNX3特異性擴(kuò)增產(chǎn)物條帶吸光度值與GAPDH條帶吸光度值之比半定量分析各細(xì)胞系的基因表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 MSP檢測

用RUNX3基因甲基化特異性引物及非甲基化特異性引物擴(kuò)增修飾后的 DNA，MSP后Reh、HL－60、K562細(xì)胞系分別在甲基化特異性擴(kuò)增(methylation)、非甲基化特異性擴(kuò)增(unmethylation)、甲基化特異性擴(kuò)增得到了預(yù)期大小的擴(kuò)增片段，見圖1。提示RUNX3基因P2啟動(dòng)子在Reh、K562細(xì)胞系中為甲基化狀態(tài);而HL－60細(xì)胞系RUNX3基因P2啟動(dòng)子為非甲基化的狀態(tài)。

Figure 1.The methylation status of RUNX3 gene P2 promoter in Reh，HL －60 and K562 cells.M:marker;Me:methylation－specific products;U:unmethylation－specific products;NC:negative control.圖1 MSP結(jié)果

2 RT－PCR檢測

用RUNX3基因RT－PCR特異性引物及GAPDH引物進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，HL－60細(xì)胞RNA進(jìn)行RT－PCR一步法擴(kuò)增后，RT－PCR特異性引物得到了預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，見圖2，而Reh及K562細(xì)胞系RNA無RUNX3基因RT－PCR特異性引物擴(kuò)增的預(yù)期大小產(chǎn)物。GAPDH在RT－PCR擴(kuò)增時(shí)作為內(nèi)參照，都有預(yù)期大小產(chǎn)物生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在Reh及K562細(xì)胞系，無RUNX3基因表達(dá)，而在HL－60細(xì)胞系有RUNX3基因的表達(dá)，見表2。

討 論

目前認(rèn)為，癌基因的激活與過量表達(dá)與腫瘤形成有關(guān)，同時(shí)，抑癌基因的丟失或失活也可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。在抑癌基因的失活或活性降低的發(fā)生過程中，抑癌基因的甲基化可能是一個(gè)重要機(jī)制。對這一問題的研究有助于我們對腫瘤發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識。

Figure 2.The expression of RUNX3 gene in Reh，HL －60 and K562 cells.M:marker;152 bp:RT－PCR product of RUNX3 gene;208 bp:RT－PCR product of GAPDH;NC:negative control.圖2 RT－PCR結(jié)果

表2 白血病Reh、HL－60、K562細(xì)胞系RUNX3 mRNA的表達(dá)Table 2.The expression of RUNX3 mRNA in Reh，HL －60 and K562 cells(.n=5)

表2 白血病Reh、HL－60、K562細(xì)胞系RUNX3 mRNA的表達(dá)Table 2.The expression of RUNX3 mRNA in Reh，HL －60 and K562 cells(.n=5)

The relative expression level of RUNX3 was normalized against the level of GAPDH.

Cell RUNX3mRNA expression Reh 0 K562 0 HL60 1.36 ±0.19

RUNX3基因?yàn)榻陙戆l(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑癌基因，該基因位于人染色體1p36.1上，含有P1、P2兩個(gè)啟動(dòng)子，其中P2啟動(dòng)子中CG含量高達(dá)64%。RUNX3基因編碼的蛋白質(zhì)為含有415個(gè)氨基酸的RUNX3蛋白，它廣泛表達(dá)于各種類型的細(xì)胞，尤其在人消化道上皮細(xì)胞及血液細(xì)胞最為顯著［3］。RUNX3的抑癌機(jī)制被認(rèn)為可能與轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growthfactor beta，TGF－β)的功能有關(guān)，為其下游通路的一個(gè)環(huán)節(jié)，參與細(xì)胞生長的負(fù)調(diào)控［4］。

DNA的甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMT)的作用下，將甲基添加到胞嘧啶(C)的5位碳原子上，轉(zhuǎn)變成5－甲基胞嘧啶。一個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域CpG島異常甲基化(高甲基化)常導(dǎo)致該基因的表達(dá)下調(diào)或缺失。

研究發(fā)現(xiàn)，在多種實(shí)體瘤中，癌組織有RUNX3基因啟動(dòng)子的高甲基化率，而相應(yīng)正常組織RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化率低或是非甲基化的狀態(tài)。并且認(rèn)為，RUNX3基因P2啟動(dòng)子的甲基化是導(dǎo)致該基因失活、表達(dá)缺失、促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。

關(guān)于RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)在白血病細(xì)胞系及白血病患者中的報(bào)道較少。在僅有的幾篇報(bào)道中，對一些細(xì)胞系的甲基化狀態(tài)研究方面存在矛盾的結(jié)果。白血病因類型、染色體改變、免疫表型、融合基因等不同，所采取的治療方案也不同。因此對于白血病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，有助于對白血病治療方案的選擇。例如作為急性髓性白血病的一個(gè)特殊類型，急性早幼粒細(xì)胞白血病針對其特殊的分子發(fā)生機(jī)制有獨(dú)特的治療方法，并且有較好的治療效果。因此對不同類型白血病發(fā)病機(jī)制的探究，將有助于白血病的治療。

在本研究中，Reh及K562細(xì)胞系，RUNX3基因P2啟動(dòng)子的甲基化為陽性，RT－PCR檢測無該基因的表達(dá);而在HL－60細(xì)胞系RUNX3基因P2啟動(dòng)子的甲基化為陰性，RTPCR檢測有該基因的表達(dá)。結(jié)合Cheng等［5］的報(bào)道，用5－氮雜2’－脫氧胞苷(5－aza－2’－deoxycytidine，5－Aza)處理Reh后，RUNX3的表達(dá)恢復(fù)，這提示我們:在白血病Reh及K562細(xì)胞系，RUNX3基因P2啟動(dòng)子為甲基化的狀態(tài)，P2啟動(dòng)子的甲基化可能是導(dǎo)致該基因失活、基因表達(dá)缺失的重要因素。這個(gè)機(jī)制可能在Reh及K562細(xì)胞系所代表的急性淋巴細(xì)胞白血病及慢性髓性白血病的發(fā)病過程中起到一定作用。上述3種細(xì)胞系之間RUNX3基因表達(dá)的明顯差異(P＜0.01)可能就在于它們之間RUNX3基因P2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的不同。因本實(shí)驗(yàn)中，急性淋巴細(xì)胞性白血病及慢性髓性白血病只分別選取了1種細(xì)胞系，不能代表該類型所有細(xì)胞系。Cheng等［5］認(rèn)為在急性淋巴細(xì)胞白血病及慢性髓性白血病細(xì)胞中RUNX3基因啟動(dòng)子的甲基化率分別為2/4和1/2。在白血病的發(fā)病機(jī)制中，傳統(tǒng)認(rèn)為染色體易位、蛋白融合是一個(gè)重要的特征，而目前認(rèn)為有遺傳和表觀遺傳機(jī)制的共同作用。表觀遺傳作用在腫瘤發(fā)生過程中的作用越來越被學(xué)者們所認(rèn)識［6］。

RUNX3基因P2啟動(dòng)子甲基化在多種腫瘤中都有發(fā)生，并且在很多實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在癌前病變中就有該基因的失活。李文慶等［7］認(rèn)為，RUNX3的表達(dá)與幽門螺桿菌感染相關(guān)胃黏膜病變程度呈明顯的負(fù)相關(guān)，病變越重表達(dá)越低。Li等［8］發(fā)現(xiàn)在胃黏膜的腸化生組織比正常上皮細(xì)胞的RUNX3表達(dá)明顯降低。因此提示我們RUNX3基因可作為早期診斷的分子指標(biāo)。在白血病發(fā)病的高危人群，我們可以通過檢測RUNX3基因P2啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，進(jìn)行早期診斷，以期早治療。

RUNX3基因P2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可作為預(yù)后診斷的因素。Araki等［9］在對肺癌病例進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，RUNX3高表達(dá)的病例5年生存率明顯高于低表達(dá)者，認(rèn)為RUNX3可以作為預(yù)后診斷的因素。林東軍等［10］在研究急性白血病患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，存在RUNX3啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的患者首次化療后完全緩解率低于未甲基化者，認(rèn)為對RUNX3啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的檢測有助于對預(yù)后的估計(jì)。黃珍等［11］在研究兒童急性白血病時(shí)也有相同結(jié)論。因而，對于RUNX3基因P2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的研究有助于我們對白血病患者預(yù)后的判斷。

與遺傳學(xué)的變化不同，表觀遺傳學(xué)的修飾具有可逆性，可以通過藥物處理使其發(fā)生逆轉(zhuǎn)，使得表觀遺傳學(xué)的改變可以作為藥物治療的靶點(diǎn)。在一些實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)RUNX3的表達(dá)，使細(xì)胞生長速度減慢，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長［12］，因而也為臨床白血病的治療提供了一個(gè)新的方向。目前，已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)［13］利用核苷類似物來抑制DNMT活性，達(dá)到降甲基化的目的。但同時(shí)也有學(xué)者提出了不同的看法，認(rèn)為在降甲基化治療的同時(shí)，可能引起其它腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［14］。這些問題尚需要進(jìn)一步研究探索。

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