王平 李敏 丁樹哲

1 華東師范大學體育與健康學院（上海 200241）

2 太原科技大學體育學院 3 商丘師范學院體育學院

國內外學者普遍認為，長期反復抗阻運動導致骨骼肌肥大。其根源是蛋白質合成率遠大于蛋白質分解以致蛋白質積累，導致肌纖維橫截面積增大，骨骼肌質量增加［1］。已有研究顯示，骨骼肌質量發(fā)生微小變化可能對骨骼肌功能起著決定性作用［2］。以往研究顯示，抗阻運動導致骨骼肌IGF-1 mRNA和蛋白表達均增加［3］。骨骼肌外源性補給IGF-1，蛋白合成明顯增加［4］，提示運動促進旁分泌途徑或骨骼肌自分泌途徑，導致骨骼肌IGF-1增加，促進蛋白質合成增加。但最近，Spangenburg等人對上述觀點提出質疑，他們使用IGF-1受體轉基因大鼠研究發(fā)現(xiàn)，雖然IGF-1和胰島素能與IGF-1受體結合，但不能活化蛋白激酶B（Akt/protein kinase B，PKB），未引起下游信號發(fā)生，但發(fā)生骨骼肌肥大，提示IGF-1信號并不是調控骨骼肌肥大的唯一信號；同時，他們也證實mTOR信號途徑是骨骼肌肥大所必需的［5］。本文對近年來mTOR介導抗阻運動骨骼肌蛋白質合成的機制研究進行綜述，為骨骼肌肥大的細胞調控機制研究提供參考。

1 mTOR與抗阻運動骨骼肌蛋白質合成

抗阻運動是骨骼肌蛋白質合成與肌細胞增長強有力的刺激劑，其機制是mTOR通路的激活。mTOR是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分子量289 kDa，為磷脂酰肌醇激酶相關激酶（phosphatidylinositol kinase-related kinase，PIKK）蛋白質家族成員，在進化上高度保守［6］。mTOR具有廣泛生物學功能，可整合營養(yǎng)、能量及生長因子等多種細胞外信號，參與基因轉錄、蛋白質翻譯、核糖體合成等過程，在細胞生長過程中發(fā)揮極其重要的作用。在哺乳動物細胞中，mTOR存在兩種不同復合物形式，即mTORC1（mTOR complex1）和mTORC2（mTOR complex2）。TORC1 由 mTOR、Raptor（regulatory associated protein of mTOR） 和Gβl（G protein β-subunit-like，也稱 mLST8）形成一個對雷帕霉素（rapamycin）抑制敏感的復合物。TORC2復合物由mTOR、Rictor（rapamycininsensitive companion of mTOR）、mLST8和 Sin1（stress-activated-protein-kinase-interacting protein 1，也稱 Mip1）構成［7］。

到目前為止，許多研究證實：抗阻運動誘導骨骼肌肥大過程中，兩種形式mTOR均起著調節(jié)蛋白質合成的作用［7，8］，主要機制可能是mTOR通過磷酸化其下游靶蛋白40S核糖體S6蛋白激酶（p70ribosomal proteinS6 kinases，p70S6K）， 如S6K1及真核啟動因子4E結合蛋白1（eukaryoticinit iationfactor4Ebindingprotein1，4E-BP1）來調節(jié)下游蛋白質翻譯。活化的S6K1可磷酸化下游底物，如40S核糖體蛋白S6（p70S6）等，促進延長因子-1α（elongation fator-1α，EF-1α）、poly（A）結合蛋白等蛋白質翻譯及表達。mRNA 5’端的7-甲基鳥苷帽子結構（cap）可被24 kDa的真核起始因子-4E（eukaryoticinitiationfactor-4E，eIF4E）識別并夾住，支架蛋白eIF4G與eIF4E及eIF4A結合并使后二者穩(wěn)定。4E-BP1與eIF-4E結合并抑制其活性，進而抑制依賴eIF-4E轉錄的啟動及蛋白質的表達。當mTOR磷酸化4E-BP1后，可使其激活，活化的4E-BP1與eIF-4E分離，從而促成eIF4E與eIF4G結合，eIF4F復合物形成，促進cap-依賴的翻譯［9］。Hans［10］研究一次性抗阻訓練發(fā)現(xiàn)，肌肉蛋白質合成率在運動過程中明顯下降，運動后1~2小時mTOR通路激活，即mTORSer2448位點發(fā)生磷酸化，其上游分子Akt及下游分子S6K1和4E-BP1活性明顯增強，蛋白質合成率明顯增加，提示mTOR是調控蛋白質翻譯開始的關鍵蛋白。

2 Akt信號通路與mTOR調節(jié)抗阻運動蛋白質合成

目前，研究比較清楚的調控抗阻運動骨骼肌mTOR信號途徑的軸是IGF-1/Akt/mTOR。其具體機制為：IGF-1/胰島素等生長因子與骨骼肌細胞膜上的受體特異性結合，引起其受體發(fā)生磷酸化，磷酸化的受體募集其受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）到細胞膜并使其發(fā)生磷酸化，磷酸化的IRS-1激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）。該激酶的活化使位于細胞膜上的磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 4,5 trisphosphate，PIP2）磷酸化，即在其肌醇環(huán)3位上添加一個磷酸基團，從而形成PIP3（phosphatidylinositol 3,4,5 trisphosphate，PIP3）。PIP3的形成對于Akt的募集及mTOR的激活是必需的［11，12］。Akt/PKB對mTOR信號的調控是通過結節(jié)性硬化癥復合物（tuberous sclerosis complex，TSC）完成的。TSC 蛋白復合物是TSC1和TSC2的異質二聚體，它對mTOR活性具有抑制作用。TSC1或TSC2基因剔除細胞或動物均具有高活性mTOR［13］。最近研究發(fā)現(xiàn)Rheb作為TSC 基因的下游作用因子參與了mTOR通路的調控，其具體機制可能是Rheb（一種單體蛋白）與GTP或GDP結合引起的結構改變使其處于激活或失活狀態(tài)。TSC蛋白具有和Rap1-GTP酶激活蛋白（GTPaseactivating protein，GAP）高度同源的GAP區(qū)域，可激活內源性GTP 酶活性，從而使Rheb蛋白結合的GTP變?yōu)镚DP，導致Rheb蛋白失活。TSC2 C端GAP區(qū)域高度保守，與Rheb蛋白的相互作用具有特殊GTPase和GAP的結合區(qū)域，是TSC2的靶分子［14，15］。在結節(jié)性硬化癥患者中發(fā)現(xiàn)mTOR通路活性增高，而Rheb蛋白和TSC蛋白分別作為mTOR通路的正性和負性調節(jié)因子［16］；Akt直接使TSC2上的許多殘基磷酸化，至少2個位點，分別是Ser939和Thr1462，TSC2磷酸化抑制了GAP活性，導致Rheb-GTP結合增加，同時增強了mTOR活性。Nader等［17］利用急性負載模型研究發(fā)現(xiàn)，在機械刺激后即刻，Akt蘇氨酸308和絲氨酸473發(fā)生磷酸化。在肌肉肥大代償模型中發(fā)現(xiàn)，Akt磷酸化水平明顯提高［5］。Wan［18］等發(fā)現(xiàn)骨骼肌TSC1發(fā)生過度表達，導致骨骼肌質量下降20%，脛骨前肌和趾長伸肌橫截面積均明顯下降，導致肌肉萎縮。根據(jù)上述情況推測，對TSC1基因的抑制可能是骨骼肌發(fā)生肥大的關鍵因素；而TSC2沒有發(fā)生明顯變化，但是表現(xiàn)出對mTOR信號的明顯抑制。也有研究在骨骼肌肥大代償模型中發(fā)現(xiàn)，TSC2 Ser1345和 Thr1462 位點發(fā)生了磷酸化［19］。Drummond［20］等進行一次抗阻運動和營養(yǎng)補充，利用肌肉活檢技術研究發(fā)現(xiàn)，運動后6小時TSC1 mRNA和TSC2 mRNA明顯下降，Rheb mRNA明顯增加。盡管關于這方面的報道不是很多，但是這些發(fā)現(xiàn)足以證明Akt的下游因子TSC和Rheb在調控mTOR通路方面具有重要作用。

由于mTOR通路調控比較復雜，描述具體機制相對困難，目前了解比較清楚的是，只要使mTOR分子的Ser-2448位點和Ser-2481位點發(fā)生磷酸化的蛋白，均能直接或間接影響mTOR的活性，從而進一步調節(jié)S6K1和4EBP-1活性，以調控蛋白質翻譯。機械負載能夠使mTOR分子Ser-2448位點發(fā)生磷酸化，從而激活mTOR通路［21］?？棺柽\動明顯增強mTOR通路，其下游因子S6K1和4EBP-1的活性也明顯增加，骨骼肌蛋白合成增加［22］。

3 氨基酸與mTOR調節(jié)抗阻運動蛋白質合成

除Akt調節(jié)mTOR途徑外，氨基酸作為重要的營養(yǎng)信號也調控mTOR通路，調節(jié)蛋白質合成。對哺乳動物細胞的研究發(fā)現(xiàn)，如果氨基酸缺乏，尤其是亮氨酸缺乏，mTOR通路抑制，導致蛋白質合成率明顯減少；但如果補充氨基酸，這種現(xiàn)象立即發(fā)生逆轉［23］。有關嚙齒類動物和人的實驗證實，補充必需氨基酸尤其是亮氨酸可通過激活mTOR通路進而增強蛋白質合成［24，25］。目前，氨基酸調節(jié)mTOR通路這一觀點已被普遍接受，但其具體機制尚不明確。有學者提出氨基酸調節(jié)mTOR通路依賴TSC1/TSC2［26］，也有學者提出其獨立于TSC1/TSC2［27］。一些研究顯示，Rheb在氨基酸調控mTOR通路中必不可少［28］，氨基酸缺乏會導致Rheb與mTOR結合減弱［29］。但也有相反的觀點，即Rheb不參與mTOR通路，而是氨基酸缺乏時，引起mTOR復合物構型變化，最終導致mTOR活性下降［30］。最近研究顯示，hVps34參與氨基酸調節(jié)mTOR通路，并且完全獨立于Akt/PKB-TSCRheb通路［31，32］。對果蠅和哺乳動物細胞的研究發(fā)現(xiàn)，Rag蛋白的異源二聚體復合物在氨基酸調節(jié) mTOR/TORC1 通路中起重要作用［33，34］。但在mTOR/TORC1通路中，hVps34、Rag與氨基酸之間如何調節(jié)，尚不清楚，需要進一步研究。關于氨基酸與抗阻運動方面的研究很少。Hartman等［35］證實，補充必需氨基酸尤其是亮氨酸的同時進行抗阻運動能明顯增加蛋白質合成率，使肌纖維橫截面積明顯增大，骨骼肌質量明顯增加。為了進一步證實其研究結果，他們進行了細胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)氨基酸能夠促進蛋白質合成，并且激活mTOR，從而激活其下游p70S6激酶。此激酶的功能是磷酸化核糖體S6，它在蛋白質翻譯過程中非常重要。其具體機制可能與細胞內鈣離子和hVps34有關，但是否直接作用于mTOR還不是很清楚。最近研究顯示，氨基酸可通過Rag GTPases，Rheb或MAP激酶4間接調節(jié)mTOR信號傳導通路。但是氨基酸不會激活Akt，因此，它不會作用于Akt/mTOR信號的上游，提示胰島素樣生長因子/胰島素和氨基酸通過各自獨立的途徑影響mTOR信號。

4 機械刺激與mTOR調節(jié)抗阻運動蛋白質合成

自Bodine［36］發(fā)現(xiàn)機械負載導致骨骼肌肥大與mTOR通路有關以來，許多學者也證實了在哺乳動物骨骼肌肥大方面，機械負載確實激活了mTOR信號。但是關于他們之間確切機制了解不多。離體肌肉拉伸和細胞培養(yǎng)拉伸模型證實：（1）被動拉伸刺激對于mTOR信號的激活是必需的；（2）拉伸刺激激活mTOR信號獨立于PI3K；（3）機械拉伸在氨基酸或生長因子均缺乏的狀態(tài)下仍能激活mTOR信號［37-39］。且拉伸刺激激活mTOR通路時必須有細胞骨架［7］。另外，其他一些研究發(fā)現(xiàn)，拉伸刺激激活mTOR通路中磷脂酶D1（phospholipase D1，PLD1）和磷脂酰膽堿水解產生的第二信使物質磷脂酸（phosphatidic acid，PA）也參與了此過程［40］。其具體機制可能是PA與mTOR抑制劑雷帕霉素/FKBP12復合物競爭性結合mTOR的FRB結構域［28］。最近，Sun［41］的實驗室證實，Rheb活化mTOR信號時PLD1是必需的，他們在實驗過程中將PLD1放置于Rheb的下游和mTOR的上游，結果提示，機械刺激激活mTOR通路完全獨立于氨基酸和生長因子路徑。因此認為，機械刺激、氨基酸和生長因子途徑對于mTOR通路的激活起著協(xié)同作用。另有人報道［42］，AMPK活性變化對mTOR也產生一定影響。Thomson和Brown觀察到，肌肉中AMPK表達增加，肌肉發(fā)生萎縮，提示AMPK與mTOR呈負向調控。

另外，mTOR的活性也直接或間接受REDD2、PRAS40、rictor和raptor的影響。已有研究報道，REDD2過度表達明顯降低了mTOR活性［43］。值得注意的是，REDD2影響mTOR的機制似乎完全獨立于Akt，但其機制與TSC1/TSC2密切相關。另一信號分子PRAS40通過與raptor間接作用抑制mTOR通路，同時Akt通過磷酸化PRAS40的Thr-246位點，使PRAS40從mTOR復合物中分離出來，最終減緩了PRAS40對mTOR通路的抑制［21］。那么 REDD2、PRAS40、rictor和 raptor在抗阻運動骨骼肌肥大過程中是否與Akt有關，他們又如何影響mTOR信號分子，關于這方面研究的文獻極少。例如Raptor是mTOR的一個調節(jié)性蛋白，包括4EBP1和p70s6k，他們能夠使mTOR結構發(fā)生磷酸化，導致骨骼肌肥大，但其具體作用機制還需進一步研究。

5 小結

mTOR信號通路在骨骼肌肥大的蛋白質合成中起重要作用，但調控mTOR通路的確切機制尚不清楚。尤其關于細胞膜如何將細胞外信號轉導到細胞內，如何刺激mTOR信號的發(fā)生，如何刺激相關下游信號分子的蛋白合成，尚需進一步研究。

［1］Kimball SR. The role of nutrition in stimulation muscle protein accretion at the molecular level. Biochem Soc Trans，2007，35（5）：1298-1301.

［2］Janssen I，Baumgartner R，Ross R，et al. Skeletal muscle cut points associated with elevated physical disability risk in older men and women. Am J Epidemiol，2004，159（4）：413-421.

［3］Adams GR，Haddad F. The relationships among IGF-1，DNA content and protein accumulation during skeletal muscle hypertrophy. J Appl Physiol，1996，81（6）：2509-2516.

［4］Parsons SA，Millay DP，Wilkins BJ，et al. Genetic loss of calcineurin blocks mechanical overload-induced skeletal muscle fi ber type switching but not hypertrophy.J Biol Chem，2004，279（6）：26192-26200.

［5］Spangenburg EE，Le Roith D，Ward CW，et al. A functional insulin-like growth factor receptor is not necessary for load-induced skeletal muscle hypertrophy. J Physiol，2008，586（7）：283-291.

［6］Jacinto E，Hall MN. TOR signalling in bugs，brain and brawn. Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4（3）：117-126.

［7］Mitsunori M，Karyn A. Cellular mechanisms regulating protein synthesis and skeletal muscle hypertrophy in animals. J Appl Physiol，2009，106（4）：1367-1373.

［8］Nader GA，Mcloughlin TJ，Esser KA. mTOR function in skeletal muscle hypertrophy：increased ribosomal RNA via cell cycle regulators. Am J Physiol Cell Physiol，2005，289（6）：C1457-C1465.

［9］ 陳洪菊，屈藝，母得志. mTOR信號通路的生物學功能.生命的化學，2010，30（4），555-561.

［10］Hans C，Satoshi F，Jerson G，et al. Presentation 7：skeletal muscle early growth response to resistance exercise in young adults：establishing a normative data set.Arch Phys Med Rehab，2006，87（10）：8-14.

［11］Chan TO，Rittenhouse SE，Tsichlis PN. Phosphoinositide 3-kinase signaling-which way to target? Trends Pharmacol Sci，2003，24（7）：366-376.

［12］趙永軍，陳彩珍，盧健.抗阻運動誘導骨骼肌生理性肥大的信號傳導通路.中國運動醫(yī)學雜志，2011，30（2）：206-210.

［13］Potter CJ，Pedraza LG，Xu T. Akt regulates growth by directly phosphorylating Tsc2. Nat Cell Biol，2002，4（9）：658-665.

［14］Zhang Y，Gao X，Saucedo L，et al. Rheb is a direct target of the tuberous sclerosis tumour suppressor proteins. Nat Cell Biol，2003，5（6）：578-581.

［15］Li Y，Inoki K，Guan KL. Biochemical and functional characterizations of small GTPase Rheb and TSC2GAP activity. Mol Cell Biol，2004，24（18）：7965-7975.

［16］Tee AR，Manning BD，Roux PP，et al. Tuberous sclerosis complex gene products，Tuberin and Hamartin，control mTOR signaling by acting as a GTPase-activatingprotein complex toward Rheb. Curr Biol，2003，13（4）：1259-1268.

［17］Nader GA，Esser KA. Intracellular signaling specifi city in skeletal muscle in response to different modes of exercise. J Appl Physiol，2001，90（5）：1936-1942.

［18］Wan M，Wu X，Guan K，et al. Muscle atrophy in transgenic mice expressing a human TSC1 transgene.FEBS Lett，2006，580（24）：5621-5627.

［19］McGee SL，Mustard KJ，Hardie DG，et al. Normal hypertrophy accompanied by phosphorylation and activation of AMP-activated protein kinase alpha1 following overload in LKB1 knockout mice. J Physiol，2008，586（2）：1731-1741.

［20］Drummond MJ，Miyazaki M，Dreyer HC，et al. Expression of growth-related genes in young and old human skeletal muscle following an acute stimulation of protein synthesis. J Appl Physiol，2009，106（4）：1403-1411.

［21］Sancak Y，Thoreen C，Peterson T，et al. PRAS40 is an insulin-regulated inhibitor of the mTORC1 protein kinase.Mol Cell，2007，25（6）：903-915.

［22］Juha JH，Jorgen T，Harri S. Resistance exercise with whey protein ingestion affects mTOR signaling pathway and myostatin in men. J Appl Physiol，2009，106（5）：1720-1729.

［23］Hara K，Yonezawa K，Weng QP，et al. Amino acid sufficiency and mTOR regulate p70S6 kinase and eIF-4E BP1 through a common effector mechanism. J Biol Chem，1998，273（34）：14484-14494.

［24］Dreyer HC，Drummond MJ，Pennings B，et al.Leucine-enriched essential amino acid and carbohydrate ingestion following resistance exercise enhances mTOR signaling and protein synthesis in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab，2008，294（2）：E392-E400.

［25］Drummond MJ，Dreyer HC，Pennings B，et al. Skeletal muscle protein anabolic response to resistance exercise and essential amino acids is delayed with aging. J Appl Physiol，2008，104（5）：1452-1461.

［26］Gao X，Zhang Y，Arrazola P，et al. Tsc tumour suppressor proteins antagonize amino-acid-TOR signalling.Nat Cell Biol，2002，4（9）：699-704.

［27］Smith EM，F(xiàn)inn SG，Tee AR，et al. The tuberous sclerosis protein TSC2 is not required for the regulation of the mammalian target of rapamycin by amino acids and certain cellular stresses. J Biol Chem，2005，280（3）：18717-18727.

［28］Foster DA. Regulation of mTOR by phosphatidic acid?Cancer Res，2007，67（1）：1-4.

［29］Long X，Ortiz-Vega S，Lin Y，et al. Rheb binding to mammalian target of rapamycin（mTOR） is regulated by amino acid suffi ciency. J Biol Chem，2005，280（25）：23433-23436.

［30］Kim DH，Sarbassov DD，Ali SM，et al. mTOR interacts with raptor to form a nutrient-sensitive complex that signals to the cell growth machinery. Cell，2002，110（2）：163-175.

［31］Byfield MP，Murray JT，Backer JM. hVps34 is a nutrient-regulated lipid kinase required for activation of p70 S6 kinase. J Biol Chem，2005，280（38）：33076-33082.

［32］Nobukuni T，Joaquin M，Roccio M，et al. Amino acids mediate mTOR/raptor signaling through activation of class 3 phosphatidylinositol 3OH-kinase. Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（40）：14238-14243.

［33］Kim E，Goraksha-Hicks P，Li L，et al. Regulation of TORC1 by Rag GTPases in nutrient response. Nat Cell Biol，2008，10（8）：935-945.

［34］Sancak Y，Peterson TR，Shaul YD，et al. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science，2008，320（5882）：1496-1501.

［35］Hartman JW，Tang JE，Wilkinson SB，et al. Consumption of fat-free fluid milk after resistance exercise promotes greater lean mass accretion than does consumption of soy or carbohydrate in young，novice，male weightlifters. Am J Clin Nutr，2007，86（13）：373-381.

［36］Bodine SC，Stitt TN，Gonzalez M，et al. Akt/Mtor pathway is a crucial regulator of skeletal muscle hypertrophy and can prevent muscle atrophy in vivo. Nat Cell Biol，2001，3（2）：1014-1019.

［37］Hornberger TA，Armstrong DD，Koh TJ，et al. Intracellular signaling specificity in response to uniaxial vs.multiaxial stretch：implications for mechanotransduction.Am J Physiol Cell Physiol，2005，288（1）：C185-C194.

［38］Hornberger TA，Chien S. Mechanical stimuli and nutrients regulate rapamycin-sensitive signaling through distinct mechanisms in skeletal muscle. J Cell Biochem，2006，97（6）：1207-1216.

［39］Hornberger TA，Stuppard R，Conley KE，et al. Mechanical stimuli regulate rapamycin-sensitive signalling by a phosphoinositide 3-kinase-，protein kinase B- and growth factor-independent mechanism. Biochem J，2004，380（15）：795-804.

［40］Hornberger TA，Chu WK，Mak YW，et al. The role of phospholipase D and phosphatidic acid in the mechanical activation of mTOR signaling in skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（12）：4741-4746.

［41］Sun Y，F(xiàn)ang Y，Yoon MS，et al. Phospholipase D1 is an effector of Rheb in the mTOR pathway. Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（24）：8286-8291.

［42］Thomson DM，Brown JD，F(xiàn)illmore N，et al. AMP-activated protein kinase response to contractions and treatment with the AMPK activator AICAR in young adult and old skeletal muscle. J Physiol， 2009，587（9）：2077-2086.

［43］Miyazaki M，Esser K. Cellular mechanisms regulating protein synthesis and skeletal muscle hypertrophyin animals. J Appl Physiol，2009，106（4）：1367-1373.