腫瘤基因治療的研究進(jìn)展

曹康，鄒毅，彭延娟

（1.成都醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，四川 成都 610083；2.廣東省食品藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心，廣東 廣州 510080；3.成都醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 成都 610083）

腫瘤是危害人類健康的重大疾病之一。目前的治療癌癥的手段，比如化療、放療、手術(shù)治療等等，可能會(huì)降低機(jī)體的免疫力，所以不能滿意地達(dá)到限制腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散的效果［1］。而研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與基因的突變有關(guān)，可以說(shuō)腫瘤是一種基因疾病。在各種物理和化學(xué)因素的作用下，原先正常的細(xì)胞中某些基因發(fā)生改變，比如原癌基因或是抑癌基因（tumor suppressor gene）突變導(dǎo)致細(xì)胞不停增殖，機(jī)體無(wú)法控制而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。此外，腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中也會(huì)不斷發(fā)生新的突變，這些突變可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物失去敏感性。因此，迫切需要尋找新的途徑來(lái)治療腫瘤。

本世紀(jì)末，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，隨著DNA重組技術(shù)的成熟，基因治療成為了一種新的治療手段。基因治療是目前腫瘤研究中一項(xiàng)重要的突破，基因治療能刺激人體免疫力，來(lái)幫助機(jī)體識(shí)別腫瘤細(xì)胞并清除腫瘤細(xì)胞?；蛑委煹脑硎菍⑼庠葱曰蚱我肽[瘤細(xì)胞內(nèi)使得腫瘤細(xì)胞中異常的基因得到控制，從而達(dá)到控制腫瘤的目的。腫瘤的基因治療包括抑制癌基因和腫瘤多藥耐藥基因的表達(dá)、抑制血管生成、激活腫瘤抑制基因等等。近年來(lái)，隨著基因治療手段的不斷發(fā)展，腫瘤基因治療獲得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，逐漸成熟。很多腫瘤基因治療的研究已經(jīng)獲得批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的階段。目前，腫瘤基因治療是腫瘤研究中非常有前景的領(lǐng)域之一。本文就腫瘤基因治療常用的方法及載體等進(jìn)行了綜述。

1 腫瘤基因治療常用的方式

1.1 導(dǎo)入抑癌基因

抑癌基因是指正常細(xì)胞本身就存在的一群基因，它們能夠抑制細(xì)胞發(fā)生突變和向腫瘤發(fā)展。抑癌基因發(fā)生了突變，失去了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞的DNA損傷可導(dǎo)致細(xì)胞DNA的突變，抑癌基因所編碼的蛋白質(zhì)就可以激活細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路，使損傷的細(xì)胞發(fā)生凋亡。如果抑癌基因失活，那么DNA突變的細(xì)胞可以繼續(xù)增殖從而導(dǎo)致癌變。研究發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤患者都存在抑癌基因的失活，所以抑癌基因的失活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。一種有效的方法是將抑癌基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，讓抑癌基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)、恢復(fù)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)表型、控制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，以達(dá)到治療腫瘤的目的?，F(xiàn)階段研究比較多的抑癌基因有p53、APC、p16、RB、DCC基因等，其中以p53基因的應(yīng)用最常見(jiàn)，很多以p53基因?yàn)榘悬c(diǎn)的治療方案已進(jìn)入臨床試驗(yàn)或已經(jīng)被批準(zhǔn)用于臨床。

p53基因是腫瘤基因治療中最為常見(jiàn)的抑癌基因靶點(diǎn)，目前對(duì)p53這種抑癌基因研究最為深入。p53基因突變或者缺失是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的一個(gè)非常重要的因素，p53基因的突變會(huì)使它失去抑制腫瘤的功能，人類很多腫瘤中都有P53的突變。通過(guò)分子克隆技術(shù)將野生型p53基因轉(zhuǎn)入到腫瘤的基因組，用以替換腫瘤細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)生突變的p53基因，到達(dá)控制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤凋亡。很多的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都表明，在腫瘤細(xì)胞中引入p53基因可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤的凋亡，效果比較明顯。不過(guò)，單一的p53基因治療腫瘤的臨床試驗(yàn)雖然已獲得較好效果。為了加強(qiáng)療效可以將p53基因治療聯(lián)合其他療法，比如化療和放療，或者聯(lián)合細(xì)胞因子的基因治療。使用p53基因的重組腺病毒（Adp53）對(duì)喉癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌和卵巢癌的治療都有較好的效果，可以腫瘤體積縮小、腫瘤壞死和腫瘤細(xì)胞凋亡等［2－5］。

1.2 抑制癌基因的表達(dá)

癌基因是一類在正常細(xì)胞基因組中就存在的基因。它是維持機(jī)體正常生命活動(dòng)所必須的基因，它的突變可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞向惡性腫瘤轉(zhuǎn)化。癌基因有其正常的生物學(xué)功能，它可以刺激細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育。在正常情況下，這類癌基因并不表達(dá)，或其表達(dá)水平很低，不足以引起細(xì)胞的病變。如果癌基因發(fā)生突變，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)速度失去控制，無(wú)節(jié)制地促使細(xì)胞生長(zhǎng)，保護(hù)這些細(xì)胞免于死亡，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生?，F(xiàn)在可以通過(guò)使用分子生物學(xué)的技術(shù)將重組質(zhì)粒或者病毒引入腫瘤細(xì)胞，表達(dá)出癌基因的反義RNA、或通過(guò)RNA干擾（RNAi）技術(shù)，以達(dá)到抑制癌基因表達(dá)的目的。目前癌基因治療常見(jiàn)的靶點(diǎn)有RAS、survivin、c－myc等。這些基因在人類許多惡性腫瘤組織中都存在，是很有代表性的腫瘤基因［6－8］。

Survivin是一種新發(fā)現(xiàn)的抗凋亡基因，只在腫瘤組織中表達(dá)，而在正常的組織中不表達(dá)。其與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)等密切相關(guān)，目前認(rèn)為Survivin是腫瘤治療的一個(gè)理想靶點(diǎn)。近來(lái)有很多研究，使用Survivin的反義核苷酸及用RNAi的方法抑制Survivin的表達(dá)取得了良好的效果［9，10］。

1.3 自殺基因治療

自殺基因又叫藥物敏感基因，當(dāng)在腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入自殺基因后，自殺基因編碼的酶可以將對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的前體藥物代謝轉(zhuǎn)化成高濃度的毒性物質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。自殺基因治療方法的另一個(gè)好處是旁觀者效應(yīng)（bystander effect，BE），即不僅殺死已經(jīng)導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細(xì)胞，而且還可以殺死其周邊的腫瘤細(xì)胞。其機(jī)制是通過(guò)血管或者細(xì)胞間的縫隙，將代謝出的毒性產(chǎn)物從導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細(xì)胞中擴(kuò)散到鄰近的腫瘤組織，從而導(dǎo)致鄰近腫瘤組織的凋亡［12］。

目前常用的自殺基因有大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因、單純皰疹病毒胸苷激酶基因、水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶基因、細(xì)胞色素氧化酶P450基因等。細(xì)胞色素氧化酶P450能將環(huán)磷酰胺轉(zhuǎn)化為磷酸胺氮芥從而發(fā)揮抗腫瘤的作用［11］。單純皰疹病毒胸苷激酶基因能將無(wú)毒的丙氧鳥(niǎo)苷磷酸化，轉(zhuǎn)化為有毒的丙氧鳥(niǎo)苷三磷酸。有研究者使用單純皰疹病毒胸苷激酶基因作為靶點(diǎn)進(jìn)行了多次臨床實(shí)驗(yàn)，并取得了良好的效果［12，13］。

1.4 抑制血管生成

腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移需要足夠的血液供應(yīng)來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。如果能干擾腫瘤血管生成就有可能控制腫瘤的生長(zhǎng)，使腫瘤出現(xiàn)壞死、凋亡、萎縮。而腫瘤的血管生成要受到促血管生成和抑制血管生成的各種因子的共同調(diào)控，通過(guò)阻斷促血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)或增強(qiáng)血管生長(zhǎng)抑制因子的表達(dá)都可達(dá)到控制腫瘤血管生成的目的。內(nèi)皮抑素（endostatin）和血管抑素（angiostatin）是腫瘤基因治療中比較常見(jiàn)和有效的抑制血管生成的分子。內(nèi)皮抑素和血管抑素能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，從而抑制腫瘤血管的生成。目前有大量的報(bào)道證明內(nèi)皮抑素和血管抑素基因治療可以用于治療腎癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌，能有效抑制腫瘤血管生成及控制腫瘤的生長(zhǎng)［14－16］。

1.5 針對(duì)一些細(xì)胞因子的基因治療

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)癌細(xì)胞的免疫耐受密切相關(guān)。原因可能是因?yàn)榘┘?xì)胞的抗原性不強(qiáng)而不能刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答，或者是因?yàn)榭乖f呈細(xì)胞不能提供足夠的共刺激信號(hào)，或者是因?yàn)闄C(jī)體細(xì)胞因子分泌不足等原因。細(xì)胞因子在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中起了重要作用。某些細(xì)胞因子的釋放，可以抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展；而另一些細(xì)胞因子可以促進(jìn)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖，加速腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。可以將某些細(xì)胞因子的基因?qū)霗C(jī)體免疫活性細(xì)胞（如DC、TIL、LAK、細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞等）中來(lái)加強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和免疫反應(yīng)能力。也可通過(guò)在腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入細(xì)胞因子受體基因的方法，讓腫瘤細(xì)胞表面的細(xì)胞因子受體表達(dá)增加，增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和免疫殺死作用。目前的報(bào)道表明，如白細(xì)胞介素（IL）－1、IL－12、IL－3、IL－24、干擾素（IFN）－γ還有各種趨化因子等許多細(xì)胞因子都能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫能力［17－20］。

1.6 針對(duì)耐藥基因的治療

腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥是一個(gè)非常棘手的問(wèn)題。有些腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化學(xué)藥物具有耐藥性，化療藥物難以將其殺死，加大化療藥物使用劑量能將腫瘤消滅，但還有可能殺傷正常細(xì)胞從而出現(xiàn)副作用。耐藥基因的存在是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥的一個(gè)重要原因。耐藥基因也叫化療保護(hù)性基因，目前研究最多的是多藥耐藥基因（multidrug resistance，MDR）。它可以將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物主動(dòng)泵出細(xì)胞外，從而使腫瘤細(xì)胞免受化療藥物的殺傷。一方面，可以使用反義RNA技術(shù)或者RNAi技術(shù)，以抑制腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥基因，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療耐藥性；另一方面，也可以通過(guò)向正常組織細(xì)胞導(dǎo)入耐藥基因，以減輕化療藥物對(duì)正常組織的毒性作用，從而提高化療的效果。目前有不少以多藥耐藥基因?yàn)榘悬c(diǎn)來(lái)治療腫瘤的報(bào)道［21－23］。

1.7 腫瘤DNA疫苗

疫苗發(fā)展經(jīng)過(guò)了3代，病原體的滅活疫苗和減毒活疫苗是第一代疫苗，亞單位疫苗是第二代疫苗，DNA疫苗是第三代疫苗。DNA疫苗是一項(xiàng)新的疫苗技術(shù)，出現(xiàn)于上世紀(jì)九十年代。研究發(fā)現(xiàn)直接肌肉和皮下注射流感病毒的裸DNA，可以使小鼠能出現(xiàn)細(xì)胞免疫和體液免疫，從而發(fā)明DNA疫苗［24］。近些年來(lái)，隨著腫瘤基因的研究取得了非常大的進(jìn)展，腫瘤的DNA疫苗也成為目前腫瘤基因治療的一個(gè)重要手段。DNA疫苗的基本原理是：當(dāng)在動(dòng)物體內(nèi)注入編碼某種抗原的外源基因后，在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的外源基因會(huì)表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，動(dòng)物體內(nèi)的蛋白酶水解酶會(huì)將這些蛋白質(zhì)分解成8～12氨基酸的多肽。這些多肽一部分被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與組織相容性復(fù)合物（MHC）－Ⅰ類分子結(jié)合，從而誘導(dǎo)CD8＋CTL的生成，出現(xiàn)細(xì)胞毒性T淋巴反應(yīng)（CTL）。另外一部分多肽與MHC－Ⅱ類分子結(jié)合，從而誘導(dǎo)CD4＋Th2細(xì)胞產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答；而且還能誘導(dǎo)CD4＋Th1細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子激活細(xì)胞和體液免疫。目前腫瘤DNA疫苗的研究已經(jīng)進(jìn)入了臨床實(shí)驗(yàn)階段。很多臨床實(shí)驗(yàn)證明，DNA疫苗是一種安全有效的抗癌手段，高效而且費(fèi)用低。

腫瘤DNA疫苗需要激活腫瘤細(xì)胞上的能引起微弱免疫反應(yīng)的腫瘤抗原，腫瘤抗原分為兩大類：腫瘤相關(guān)抗原和腫瘤特異抗原［25］。腫瘤相關(guān)抗原不只是由腫瘤細(xì)胞表達(dá)，在很多正常細(xì)胞中也有，如癌癥－睪丸抗原，人類表皮生長(zhǎng)因子受體／神經(jīng)鞘膜蛋白，癌胚抗原［26］。目前研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多腫瘤相關(guān)抗原，并用于腫瘤的基礎(chǔ)研究與臨床治療。由于目前的生物技術(shù)發(fā)展迅速，新的腫瘤相關(guān)抗原還在不斷地發(fā)現(xiàn)。不過(guò)，需要注意的是，腫瘤相關(guān)抗原在正常組織中也存在，所以DNA疫苗針對(duì)的靶點(diǎn)必須仔細(xì)選擇以防止出現(xiàn)自身免疫。腫瘤特異抗原是由物理或者化學(xué)致癌物導(dǎo)致的突變?cè)斐傻?，它們只在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，如黑色素細(xì)胞／黑色素瘤差異抗原，酪氨酸酶，MART1，gp100，前列腺特異抗原（PSA）［27－29］。

2 腫瘤基因治療相關(guān)載體

用于腫瘤基因治療的生物類載體有病毒載體和非病毒載體等。病毒是一種非常簡(jiǎn)單非常原始的生命形式，病毒可以感染人或者動(dòng)物，將其基因帶入宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中復(fù)制與表達(dá)出病毒的蛋白質(zhì)。通過(guò)基因工程手段可以將病毒的基因進(jìn)行改造，將目的基因插入病毒的基因組，當(dāng)病毒感染宿主后目的基因可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)。病毒類載體最常見(jiàn)的有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺相關(guān)病毒載體。其他能作為載體病毒還有單純皰疹病毒、痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、新城疫病毒等等。病毒作為基因治療的載體有靶向性好，轉(zhuǎn)染效率高等特點(diǎn)，所以目前應(yīng)用非常廣泛，有些病毒載體已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段或已經(jīng)被批準(zhǔn)成藥［30］。不過(guò)，病毒載體依然有安全性的問(wèn)題；而且病毒具有免疫原性，再次感染有一定的困難。另外，病毒作為載體所攜帶外源基因的大小有一定的限制。非病毒性載體主要有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，納米粒材料等。非病毒性載體是一種安全性良好的載體。但是相比病毒載體，它的轉(zhuǎn)染效率要低一些。非病毒載體制備較為簡(jiǎn)單，攜帶的外源基因的容量也比較大，而且保存與運(yùn)輸方便［31］。此外還有一些物理方法可以在基因治療的給藥中使用，比如電穿孔、基因槍、顯微注射等，這些都是有效并有應(yīng)用前景的方法。

3 前景與展望

基因治療作為一種全新理念的治療方法取得了非常大的成就。目前已經(jīng)有多種基因治療的產(chǎn)品已經(jīng)批準(zhǔn)上市或者進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，比如編碼p53基因的腺病毒產(chǎn)品已經(jīng)在我國(guó)獲批用于臨床。腫瘤基因治療雖然目前發(fā)展很快，但是還有很多問(wèn)題沒(méi)有解決。很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好，但是在對(duì)于人體效果卻不理想。有很多待解決問(wèn)題，比如如何發(fā)現(xiàn)更加高效的載體、怎樣增加基因治療的靶向性、怎樣發(fā)現(xiàn)更有效的基因靶點(diǎn)、怎樣保證基因治療的安全性等等。相信隨著科學(xué)的進(jìn)步，基因治療手段的不斷革新，腫瘤的基因治療必將擁有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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