莊彥，徐希，章圣輝，俞康

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000，1.血液科；2.醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所）

欖香烯（elemene）是從姜科植物溫郁金（溫莪術(shù)，curcuma Wenyujin）中提取的半萜烯類化合物，其主要成分是為β-欖香烯（化學(xué)名：1-甲基-1-乙烯基-2，4-二異丙基環(huán)己烷；分子式：C15H24，分子量：204），是我國自行開發(fā)研制的II類非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥[1]，由于其抗瘤譜廣[2]，療效確切，能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥并具有鎮(zhèn)痛[3]、放化療增敏作用[4]，且不良反應(yīng)輕微，無骨髓抑制，無肝腎損害，因而越來越多的在腫瘤的臨床治療中獲得應(yīng)用。本實驗通過欖香烯對慢性粒細(xì)胞白血病急性髓系變的K562細(xì)胞株體外和體內(nèi)的抑制作用，探討其用于髓系白血病治療的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器：K562細(xì)胞株由本室保存；欖香烯乳注射液由大連金港制藥有限公司提供（0909251）；胎牛血清、RPMI1640購自美國GIBCO公司；AnnexinV/PI購自美國invitrogen公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所；DAPI染液購自碧云天生物研究所；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；熒光顯微鏡OLYMPUS BX41；全自動酶標(biāo)儀ELX400。

1.1.2 實驗動物：SPF 級SCID Beige小鼠，6～8周齡，體重為16～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2006-0009。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：K562細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.2.2 細(xì)胞生長抑制試驗：K562細(xì)胞以1.0×104個/孔接種到96孔板中，使用10、20、30、40μg/mL的欖香烯處理，每孔總體積為100μL。各個濃度均設(shè)6個復(fù)孔，另設(shè)空白對照孔和調(diào)零孔。在培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72 h后，各取出1塊96孔板，每孔加入CCK-8溶液10μL，混勻后37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3 h，酶標(biāo)儀450 nm波長測吸光度（A450）。生長抑制率=（對照孔A值-實驗孔A值）/對照孔A值×100%。

1.2.3 Annexin V/PI熒光標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡：將1.0×105個/mL的細(xì)胞接種于6孔板上，使用10、20、30、40、50μg/mL的欖香烯處理48 h。收集細(xì)胞，PBS洗2次，按AnnexinV-FITC/PI 試劑盒說明書操作，采用Cellquest 3.2分析軟件獲取和分析結(jié)果。

1.2.4 DAPI染色分析核形態(tài)：前期處理同細(xì)胞凋亡檢測，48 h后收集細(xì)胞，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定，細(xì)胞團滴片，風(fēng)干，加入10μL的DAPI染液染色15 min，封片，使用免疫熒光顯微鏡進行觀察（波長為340～380 nm，放大倍數(shù)為1000倍）。

1.2.5 體內(nèi)抑瘤實驗：取16只SCID小鼠，分別標(biāo)記，將一側(cè)背部剃毛用于細(xì)胞皮下接種。K562細(xì)胞接種前2 d，每天予腹腔注射環(huán)磷酰胺2 mg/只，共2 d。調(diào)整K562細(xì)胞濃度為6×107個/mL，每只小鼠于背部皮下接種0.1 mL。接種后第4天，將小鼠隨機分為正常對照組和欖香烯組，每組8只。欖香烯組每天腹腔注射欖香烯125 mg/kg（約2.5 mg/只），對照組每天腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)注射14 d，每隔2 d用游標(biāo)卡尺測定腫瘤長短徑，按下式計算腫瘤體積：腫瘤體積=（長徑×短徑2×0.52）。于第24天處死小鼠，剝離瘤體，稱量，計算腫瘤生長抑制率IR：IR =（1-給藥組平均瘤質(zhì)量）/正常對照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件，不同藥物濃度組間比較采用完全隨機設(shè)計的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 欖香烯體外抑制K562細(xì)胞增殖 結(jié)果見表1、圖1，欖香烯對K562細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，并呈量效和時效關(guān)系。40μg/mL的欖香烯作用24、48、72 h的抑制率分別為45.1%、63.1%、89.1%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

表1 β-欖香烯對人髓系白血病K562細(xì)胞的增殖抑制作用（±s，n=6）

表1 β-欖香烯對人髓系白血病K562細(xì)胞的增殖抑制作用（±s，n=6）

欖香烯濃度（mg/L）24 h抑制率（%）0 10 20 30 40吸光度0.555±0.045 0.490±0.022 0.477±0.032 0.424±0.018 0.305±0.030 48 h 72 h抑制率（%） 吸光度1.172±0.034 1.026±0.114 0.947±0.096 0.315±0.080 0.128±0.006吸光度0.890±0.054 0.782±0.051 0.744±0.055 0.522±0.045 0.328±0.023 11.6 14.0 23.5 45.1抑制率（%）12.1 16.4 41.3 63.1 12.4 19.2 73.1 89.1

圖1 不同濃度和作用時間下欖香烯對K562細(xì)胞的生長抑制作用

2.2 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué) 未經(jīng)欖香烯處理的細(xì)胞，核膜光滑、核質(zhì)均一；經(jīng)不同濃度欖香烯處理48 h后的細(xì)胞核具有凋亡細(xì)胞核的特征性核形態(tài)，細(xì)胞核呈折縫樣，染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮，核膜破裂，染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核裂解為碎塊等。見圖2。

2.3 欖香烯誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡 欖香烯作用48 h后，Annexin V-FITC/PI雙染后流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，10、20、30、40、50μg/mL欖香烯早期細(xì)胞凋亡率分別為（2.38±1.04）%、（2.98±1.36）%、（4.99±1.96）%、（18.03±2.45）%、（53.58±4.34）%。與陰性對照組的（1.10±0.47）%相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），并呈劑量依賴性。見圖3。

圖2 經(jīng)不同濃度欖香烯處理K562細(xì)胞DAPI染色結(jié)果

圖3 欖香烯對K562細(xì)胞作用48 h的凋亡率（%）

2.4 欖香烯體內(nèi)抑制K562細(xì)胞增殖 接種4 d后皮下可見較均一的瘤狀突起，并隨時間延長不斷長大。16只SCID鼠均移植成功，經(jīng)觀察和測量，經(jīng)125 mg/kg欖香烯處理的小鼠腫瘤生長較對照組明顯減緩（見圖4），至觀察期末，兩組均無小鼠死亡。接種24 d后將小鼠處死小鼠，將剝離的瘤體稱重，對照組瘤重均值為（0.341±0.074）g，實驗組瘤重（0.095±0.031）g，按公式計算的腫瘤抑制率為72.1%。

圖4125 mg/kg欖香烯對K562細(xì)胞株的體內(nèi)抑制作用

2.5 病理學(xué)觀察 經(jīng)HE染色后于光鏡下觀察，實驗組腫瘤組織中細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死，腫瘤中組織內(nèi)血管分布較少，對照組中，腫瘤細(xì)胞形態(tài)清晰，壞死較少，血管豐富，兩組對比差異明顯。見圖5-6。

圖5 實驗組腫瘤組織病理切片(HE，×200)

圖6 對照組腫瘤組織病理切片（HE，×200）

3 討論

目前，血液系統(tǒng)的惡性腫瘤治療仍以細(xì)胞毒藥物化療為主要方式，腫瘤耐藥和化療對重要器官損傷是臨床經(jīng)常遇到的難題。欖香烯作為我國自主研發(fā)的二類非細(xì)胞毒性抗腫瘤新藥，具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥、抑制腫瘤血管生成、放化療增敏和調(diào)節(jié)機體免疫的功能，而且還具有骨髓抑制較輕和能透過血腦屏障的優(yōu)點，具有較廣闊的應(yīng)用前景。

本實驗表明，30μg/mL香烯對K562細(xì)胞的增殖開始出現(xiàn)明顯的抑制作用，隨著濃度的增加和作用時間的延長，增殖的抑制作用逐漸明顯，顯示出明顯的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)依賴關(guān)系。50μg/mL欖香烯處理K562細(xì)胞48 h后，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，達(dá)53.58%，并存在劑量依賴關(guān)系。DAPI染色進一步從形態(tài)學(xué)上證明了欖香烯能誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，經(jīng)欖香烯暴露48 h后，細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)呈高度濃縮、邊緣化，產(chǎn)生細(xì)胞核碎片，形成凋亡小體。對比相關(guān)文獻(xiàn)，鄒麗娟等[5]亦發(fā)現(xiàn)欖香烯其能誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，在40μg/L作用48后，凋亡發(fā)生率達(dá)58.4%，并能抑制細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)。陸羨等[6]的研究顯示了β-欖香烯能夠阻滯K562細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，30μg/L作用48 h后，凋亡率為（34.3±2.8）%。均提示β-欖香烯對K562細(xì)胞能產(chǎn)生增殖抑制作用并誘導(dǎo)其凋亡。此外，欖香烯注射液對人白血病HL-60、NB4[7]細(xì)胞株、宮頸癌Hela細(xì)胞株、肝癌Hca-F25/CL-16A3細(xì)胞株及喉癌Hep-2、肺癌A549細(xì)胞株等增殖均有顯著的抑制作用，且對多藥耐藥（MDR）的細(xì)胞株如K562/ADM、乳腺癌MCF-7/ADM、胃癌SGC7901/VCR、腦膠質(zhì)瘤U251/ADM能夠逆轉(zhuǎn)其耐藥性[8]，顯示其具有不但具有較廣的抗瘤譜、良好的抑瘤效果，還具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用。

本研究同時通過腹腔給藥，對皮下荷瘤的SCID小鼠的進行處理后發(fā)現(xiàn)， 腹腔注射125 mg/kg欖香烯的實驗組小鼠腫瘤生長較注射0.9%氯化鈉溶液的空白對照組明顯減緩，且給藥的耐受性較好，連續(xù)14 d未引起小鼠死亡，但注射后能觀察到小鼠萎靡少動，排便增多，便溏，于數(shù)小時內(nèi)恢復(fù)，對攝食影響不明顯，考慮與欖香烯對腹膜的刺激有關(guān)。在觀察期內(nèi)，兩組小鼠體重均有增加，但無明顯差異。兩組在實驗終點剝離瘤體，瘤重差異明顯，腫瘤抑制率達(dá)72.1%。HE染色也證明經(jīng)實驗組小鼠瘤體壞死程度、纖維化程度均高于對照組，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與曹忠勝等[9]將欖香烯作用于人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞株的裸鼠皮下移植模型，抑瘤率達(dá)52.24%，且無明顯不良反應(yīng)的結(jié)果相符。通過動物實驗，進一步證明了欖香烯對K562白血病細(xì)胞在體內(nèi)也具有較強抑制作用，且藥物安全性和耐受性較好。

在欖香烯的安全性方面，楊驊等[10]研究了其對正常人外周血白細(xì)胞的體外抑制作用，結(jié)果顯示其IC50為254.3μg/mL，王茜莎等[11]的研究亦顯示欖香烯對小鼠骨髓和人正常肝胚胎細(xì)胞無抑制，故顯示其具有較低的細(xì)胞毒性。在臨床治療白血病方面，亦有一些嘗試，如陳潔等[12]用欖香烯聯(lián)合化療治療難治性老年白血病23例，結(jié)果顯示總有效率為65.2%，感染、心血管事件、肝腎功能損害及出血的發(fā)生率均較低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。余惠[13]研究7例急性白血病患者，以單用或先單用欖香烯，再予原先已無效的化療方案治療后，其骨髓及外周血原始細(xì)胞均有不同程度的下降，總有效率達(dá)57%，耐受性好且不良反應(yīng)輕微，顯示了欖香烯在臨床治療白血病的可行性及有效性。

綜上所述，本研究評價了欖香烯單藥對K562細(xì)胞的體內(nèi)外作用，顯示其在體外具有明顯的促進腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，且在體內(nèi)能夠抑制K562荷瘤小鼠的瘤體生長，抑瘤率達(dá)72.1%，在連續(xù)給腹腔給藥下未出現(xiàn)小鼠死亡，顯示其有較好的安全性。通過研習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)，顯示出欖香烯逆轉(zhuǎn)多藥耐藥、放化療增敏、骨髓抑制輕微等諸多優(yōu)點，預(yù)示欖香烯在治療髓系白血病，特別是老年白血病以及難治性白血病方面有良好前景。

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