HDL3抗脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷*

桑 慧， 姚樹(shù)桐， 楊娜娜， 司艷紅， 于鳳秀， 商戰(zhàn)平， 秦樹(shù)存，△

(泰山醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)教研室，2動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東泰安271000)

血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。革蘭氏陰性細(xì)菌外膜成份脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)進(jìn)入血液循環(huán)后，可啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，刺激大量炎癥因子合成釋放，趨化炎癥細(xì)胞并促使其向血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附聚集，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損，功能紊亂。流行病學(xué)調(diào)查表明心血管疾病與高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)水平降低密切相關(guān)。HDL是血液中密度最高、顆粒最小的一種脂蛋白，其抗炎活性、膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)及抗氧化活性已成為心血管疾病預(yù)防的重要靶點(diǎn)[1]。內(nèi)毒素血癥時(shí)，HDL與 LPS結(jié)合，中和其活性，減少炎癥介質(zhì)的釋放，顯著改善LPS所致內(nèi)毒素血癥動(dòng)物模型的損傷[2]。但HDL結(jié)構(gòu)、代謝、功能具有高度異質(zhì)性，超速離心將人HDL分離為HDL2(1 063-1 125 g/L)和 HDL3(1 125-1 210 g/L)兩個(gè)亞群，HDL3接受膽固醇、酯化后轉(zhuǎn)化為HDL2。蛋白質(zhì)組學(xué)研究[3]表明 HDL3 富含 apoA-I、apoF、apoJ、apoL-I、PLTP、PON1、PAF-AH 和 LCAT，脂質(zhì)組學(xué)研究[4]表明HDL3含有豐富的鞘氨醇-1-磷脂。炎癥或脂質(zhì)代謝異常時(shí)HDL2及中等大小的HDL明顯降低，而HDL3水平無(wú)明顯變化[5]。研究表明HDL3顆粒較 HDL2具有更強(qiáng)的抗氧化性[6]。因此在炎癥、血脂代謝異常時(shí)HDL3抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用至關(guān)重要[1，7]。本研究在LPS致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)損傷模型上，研究富含apoA-I的HDL3對(duì)HUVECs炎癥性損傷及核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)活化的影響，以進(jìn)一步探討HDL的抗炎機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要藥品及試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株由南京凱基生物工程公司提供，LPS(E.coil O55∶B5)以及噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma;RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Gibco;0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Merck;Annexin-Ⅴ/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙標(biāo)記試劑盒購(gòu)自BD;ELISA試劑盒購(gòu)自RD;NF-κB p65抗體購(gòu)自Santa Cruz;增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒為 Pierce產(chǎn)品;2'，7'-二(2-羧乙基)-5(6)-羧基熒光素乙酰氧甲基酯[2'，7'-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein acetoxylmethyl ester，BCECF-AM]為北京泛博生化產(chǎn)品;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器 Sanyo CO2培養(yǎng)箱，Olympus倒置顯微鏡，721分光光度計(jì)，Bio-Rad 550酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀及電泳儀，Beckman超速離心機(jī)。

2 HDL3的提取制備

收集正常人新鮮血漿50 mL，根據(jù)文獻(xiàn)[6]報(bào)道方法制備。用 NaBr調(diào)整血漿密度為1 006 g/L，于4℃、40 000 r/min離心24 h，去除上層白色絮狀物即極低密度脂蛋白;以NaBr調(diào)整下層液體密度為1 063 g/L，相同條件下離心48 h，取出上層淡黃色液體后，再以NaBr調(diào)整下層液體密度為1 125 g/L，相同條件下離心48 h，取出上層淡黃色液體即HDL2。繼續(xù)以NaBr調(diào)整下層液體密度為1 210 g/L，相同條件下離心48 h，取出上層淡黃色液體即HDL3。將HDL3裝入透析袋用含0.1%EDTA的 PBS透析24 h，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌，4℃ 保存?zhèn)溆?。BCA試劑盒定量蛋白，調(diào)蛋白濃度至1 g/L用于實(shí)驗(yàn)。

3 HUVECs的培養(yǎng)及分組

HUVECs株復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分5組:(1)對(duì)照(control)組:正常培養(yǎng)的 HUEVCs;(2)LPS組:1 mg/L的LPS作用6 h;(3)HDL3+LPS組:分別用50 mg/L(HDL3-50)、100 mg/L(HDL3-100)和200 mg/L(HDL3-200)HDL3預(yù)孵育HUVECs 18 h后加入1 mg/L LPS作用6 h。

4 檢測(cè)指標(biāo)

4.1 HUVECs活力測(cè)定 采用MTT比色法檢測(cè)。常規(guī)消化，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108/L，每孔加入200 μL單細(xì)胞懸液傳至96孔板上，每組6孔。細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，根據(jù)分組進(jìn)行處理;培養(yǎng)終止前4 h，每孔加入5 g/L MTT 溶液 20 μL，2 000 r/min 離心5 min，吸去上清液;加200 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)振蕩混勻30 min，使結(jié)晶完全溶解;全自動(dòng)酶標(biāo)儀上，以λ=490 nm，測(cè)吸光度值(absorbance，A)。

4.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 常規(guī)消化，調(diào)細(xì)胞密度為5×108/L，將細(xì)胞傳6孔板上，每孔加入1.5 mL，細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，根據(jù)分組進(jìn)行處理。收集各組細(xì)胞并以PBS洗滌后，用Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入 5 μL Annexin V/FITC混勻，然后加入5 μL PI，混勻后室溫避光反應(yīng)15 min，用流式細(xì)胞儀(Ex=488 nm;Em=530 nm)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

4.3 單核細(xì)胞與HUVECs的黏附實(shí)驗(yàn) 在24孔板孔內(nèi)培養(yǎng)HUVECs至80%匯合，根據(jù)分組進(jìn)行處理。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 h標(biāo)記THP-1細(xì)胞。將THP-1細(xì)胞離心洗滌2遍，加入含1 μmol/L的BCECF-AM的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃避光孵育1 h，孵育結(jié)束后，離心去除未結(jié)合的BCECF-AM;RPMI-1640重懸標(biāo)記后的THP-1細(xì)胞，密度為5×109/L。以RPMI-1640洗滌HUVECs 2次后，加入0.5 mL熒光標(biāo)記的THP-1細(xì)胞，于37℃避光孵育1 h，孵育結(jié)束后，吸棄上清，PBS輕輕洗滌3次，去除未結(jié)合的THP-1細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察。每孔采圖4張，用Image-Pro Plus 6.0圖像處理系統(tǒng)計(jì)數(shù)結(jié)合的THP-1細(xì)胞數(shù)。

4.4 ELISA法檢測(cè)血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作步驟進(jìn)行。用Bio-Rad 550型酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀測(cè)量吸光度值A(chǔ)(λ=450 nm)，計(jì)算培養(yǎng)液中VCAM-1蛋白的量。

4.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)NF-κB p65 將細(xì)胞接種于放有無(wú)菌蓋玻片的6孔板中，細(xì)胞處理后，冷丙酮固定，按照SABC試劑盒說(shuō)明操作:3%過(guò)氧化物酶滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶;BSA封閉，滴加1∶200稀釋兔抗NF-κB p65單克隆抗體，室溫孵育2 h后加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗20 min;SABC溶液孵育15 min后DAB避光顯色，蒸餾水沖洗;蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。以PBS代替Ⅰ抗孵育作為陰性對(duì)照，以細(xì)胞核內(nèi)或核周邊出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，每張爬片隨機(jī)取4個(gè)視野、放大400倍采圖，用Image-Pro Plus 6.0圖像處理系統(tǒng)測(cè)量陽(yáng)性染色部位的累積吸光度(integrated absorbance，IA)進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

4.6 Western blotting檢測(cè)NF-κB p65的表達(dá) 按照核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞核蛋白，BCA法蛋白定量，將蛋白濃度調(diào)成一致，并加入5×上樣緩沖液，沸水中5 min變性，置-80℃保存。取上述蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE，8%分離膠)電泳(上樣量為 50μg)，將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上，經(jīng)封閉、洗脫后加入兔抗人NF-κB p65單克隆抗體(1∶200)，4℃過(guò)夜，洗膜后以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗室溫孵育1 h，并以兔抗β-actin(1∶8 000)單克隆抗體同上操作，作為上樣內(nèi)參。ECL顯色，暗室 X光膠片曝光。采用 Image-Pro Plus圖像分析軟件分析蛋白條帶的IA(IA=平均吸光度值×面積)，以靶蛋白IA值與β-actinIA值的比值反映靶蛋白相對(duì)水平。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 HUVECs增殖活性的變化

正常對(duì)照組的吸光度值為0.689±0.043，LPS作用于HUVECs 6 h后細(xì)胞增殖活力降低(0.626±0.026)，與正常對(duì)照組比較降低了9.22%(n=6，P＜0.01);HDL3顯著抑制LPS所致的細(xì)胞活力降低，其100 mg/L和200 mg/L預(yù)處理組A值(0.692±0.021和0.704±0.034)分別較LPS處理組增加了10.66%和12.61%(n=6，P＜0.01)，而與對(duì)照組無(wú)顯著差異(n=6，P ＞0.05)。

2 HUVECs凋亡分析

正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為2.32%±0.06%;LPS作用后細(xì)胞凋亡率(11.62% ±1.16%)較對(duì)照組明顯上升(n=4，P＜0.01);HDL3預(yù)處理后細(xì)胞凋亡率明顯降低，其100和200 mg/L HDL3預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率分別下降至6.68%±0.78%和4.58%±0.62%，與LPS組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=4，P＜0.05或 P ＜0.01)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Annexin V/PI double staining was used to detect cell apoptosis by flow cytometry.Control:HUVECs;LPS:1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-50:50mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-100:100mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-200:200mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs.圖1 Annexin V/PI雙標(biāo)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

3 單核細(xì)胞與HUVECs黏附的比較

在1 mg/L LPS作用6 h后，THP-1細(xì)胞與HUVECs黏附增加(P＜0.01)，較正常對(duì)照組增加2.77倍;HDL3預(yù)處理顯著抑制LPS所誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞與HUVECs間的黏附，50、100和200 mg/L HDL3預(yù)處理后THP-1細(xì)胞黏附數(shù)量相對(duì)于模型組分別降低了31.84%、47.68%和53.53%(P＜0.01)，且200 mg/L HDL3預(yù)處理后THP-1細(xì)胞黏附數(shù)量與正常對(duì)照相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖2、3。

Figure 2.THP-1 cells adhenent to HUVECs were observed after HDL3 treatment under fluorescence microscope.Scale bar:250 μm.Control:HUVECs;LPS:1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-50:50 mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-100:100 mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-200:200 mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs.圖2 熒光顯微鏡下觀察HDL3處理后THP－1細(xì)胞黏附于HUVECs變化

Figure 3.The numbers of THP-1 cells adherent to HUVECs after HDL3 treatment.±s.n=4.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs LPS group.圖3 HDL3處理后THP－1細(xì)胞黏附于HUVECs的數(shù)量分析

4 培養(yǎng)液中VCAM －1蛋白的改變

LPS是刺激黏附分子及炎癥介質(zhì)表達(dá)的有力的刺激因子，在它的作用下，VCAM-1蛋白表達(dá)增加，較正常對(duì)照增加1.53倍(P＜0.01);HDL3預(yù)處理可顯著抑制VCAM-1蛋白表達(dá)上調(diào)，50、100和200 mg/L HDL3預(yù)處理后VCAM-1蛋白量分別較模型組降低了19.29%、25.19%和32.72%(P＜0.05或P＜0.01);200 mg/L HDL3預(yù)處理后VCAM-1蛋白與正常對(duì)照相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Expression of VCAM-1 protein in media after HDL3 treatment.±s.n=4.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control;*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs LPS group.Control:HUVECs;LPS:1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-50:50 mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-100:100 mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-200:200 mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs.圖4 HDL3處理后細(xì)胞培養(yǎng)液中VCAM －1蛋白表達(dá)的變化

5 NF－κB p65表達(dá)的檢測(cè)

5.1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)NF-κB p65的變化 胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。對(duì)照組細(xì)胞核藍(lán)染，胞漿著色不明顯，即NF-κB p65表達(dá)較低;LPS刺激后不僅胞漿著棕黃色，大部分胞核也陽(yáng)性表達(dá)，IA值與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01);而HDL3預(yù)處理后胞漿胞核著色隨HDL3作用濃度的增高而逐漸減弱，IA值較模型組分別下降了26.24%、48.76%和60.56%(P＜0.05或P＜0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.Expression of NF-κB p65 in HUVECs after HDL3 treatment examined by immunocytochemical staining.Scale bar:20 μm.圖5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)HDL3處理后NF－κB p65蛋白表達(dá)

5.2 Western blotting檢測(cè)NF-κB p65的變化 正常對(duì)照組細(xì)胞核NF-κB p65表達(dá)水平較低;LPS刺激后核內(nèi)NF-κB p65水平顯著增高，較對(duì)照組增加14.92倍(P＜0.01);HDL3預(yù)處理則明顯抑制NF-κB的激活，且呈濃度依賴性，其細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白水平較模型組分別降低28.00%、68.35%和80.79%(P＜0.05或P＜0.01)，見(jiàn)圖6。

Figure 6.Levels of NF-κB p65 in the nucleus of HUVECs in each group detected by Western blotting.±s.n=4.#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs LPS group.圖6 Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞核內(nèi)NF－κB p65蛋白表達(dá)

討 論

LPS是導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，進(jìn)入機(jī)體后通過(guò)LPS結(jié)合蛋白，與CD14陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如NF-κB通路，導(dǎo)致炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的過(guò)度釋放，引發(fā)炎性瀑布反應(yīng)[8]，趨化炎癥細(xì)胞并促使其向血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附聚集，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損，功能紊亂。本實(shí)驗(yàn)中1mg/L LPS作用于HUVECs后細(xì)胞增殖活性降低、凋亡數(shù)增加，VCAM-1分子表達(dá)增加，NF-κB p65向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，表明LPS誘導(dǎo)HUVECs炎癥性損傷。

HDL具有拮抗LPS所誘導(dǎo)的炎癥作用，可與LPS結(jié)合，直接被肝細(xì)胞上的SR-B1受體結(jié)合而降解[9，10]，還可以通過(guò) HDL 脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化作用移除或滅活炎癥脂質(zhì)，進(jìn)而抵消 LPS的炎癥介質(zhì)作用[11]。但HDL是顆粒大小、密度、組成、功能極不均一的脂蛋白，HDL3相對(duì)于HDL2體積小、膽固醇含量低而蛋白含量高。炎癥或血脂異常時(shí)，HDL結(jié)構(gòu)改變，膽固醇含量減少而甘油三酯增加，這種HDL顆粒apoA-I結(jié)合松、易脫落，結(jié)果循環(huán)中HDL2及中等大小的HDL明顯降低，而HDL3顆粒水平相對(duì)穩(wěn)定[5]。富含甘油三酯的HDL2顆粒向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇功能也受到影響，HDL介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)向了巨噬細(xì)胞[7]。因此炎癥時(shí)HDL3顆粒承擔(dān)了主要的抗炎作用。

本實(shí)驗(yàn)中HDL3預(yù)處理HUVECs可顯著恢復(fù)細(xì)胞活力，且呈濃度依賴性。AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證實(shí)HDL3預(yù)處理可以減輕LPS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。與Ashby等[12]報(bào)道HDL3抑制 VCAM-1的表達(dá)一致，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)HDL3處理18 h后，VCAM-1的表達(dá)降低，單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附減少。Thaveeratitham等[13]證明貧脂HDL能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的白細(xì)胞黏附，而脂質(zhì)成分卻沒(méi)有此效應(yīng)，因此HDL3減輕LPS的損傷作用與HDL3蛋白含量密切相關(guān)。LPS的生物學(xué)活性中心lipidA的結(jié)構(gòu)非常保守，是LPS分子中最穩(wěn)定的部分，HDL與LPS結(jié)合時(shí)LPS的 lipidA插入到HDL分子外殼的磷脂層，有效地封閉LPS的活性中心。HDL3抑制黏附分子表達(dá)的能力不僅與HDL3內(nèi)豐富的載脂蛋白如apoA-I、apoA-IV有關(guān)，還與HDL3中存在的磷脂，如鞘氨醇-1-磷脂、磷酯膽堿有關(guān)[3，4，9，12]。

NF-κB是已知的調(diào)控VCAM-1等炎癥因子表達(dá)的誘導(dǎo)型核轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下多以p50和p65二聚體與其抑制蛋白IκB相結(jié)合而存在于胞漿中，呈無(wú)活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到LPS、氧化應(yīng)激等外源性刺激后，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起IκB降解，導(dǎo)致NF-κB-IκB復(fù)合物解體，NF-κB活化進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因特異序列結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)諸多炎癥介質(zhì)如 VCAM-1、TNF-α、IL-1、IL-6 等過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而引起炎癥細(xì)胞黏附聚集，導(dǎo)致組織細(xì)胞級(jí)聯(lián)放大的炎癥損傷反應(yīng)[14]。本實(shí)驗(yàn)免疫細(xì)胞化學(xué)染色及Western blotting檢測(cè)均表明HDL3預(yù)處理可抑制NF-κB p65向細(xì)胞核中轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步證實(shí)HDL3降低了LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。盡管有報(bào)道[15]HDL在急性炎癥反應(yīng)時(shí)，可轉(zhuǎn)化為促炎介質(zhì)，但本實(shí)驗(yàn)中的得到的數(shù)據(jù)仍支持HDL的抗炎作用，其中HDL3可能起了決定性的作用。

綜上所述，HDL3可通過(guò)抑制NF-κB所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)減輕HUVECs損傷。但有關(guān)HDL3抗炎機(jī)制的研究尚需從其結(jié)構(gòu)組成進(jìn)一步深入探討。

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