同型半胱氨酸硫內(nèi)酯損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制研究*

劉玉暉， 游 宇

(1江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，江西南昌330004;2南昌大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，江西南昌330006)

流行病學(xué)研究證明，高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)血癥是人類許多疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦中風(fēng)、外周血管栓塞性疾病等[1，2]。正常情況下，Hcy在甲硫氨酸合酶或甜菜堿－Hcy甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼?，或在胱硫?β－合成酶(cystathionine β－synthetase)和維生素B6作用下，通過轉(zhuǎn)硫過程分解為胱硫醚，繼而轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?。如果遺傳性地缺少關(guān)鍵酶以及維生素B12等維生素時(shí)，Hcy不能進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)化與代謝，而是在氨?；鵷RNA合成酶(aminoacyl－tRNA synthetases，AARSs)作用下，進(jìn)行分子內(nèi)的反應(yīng)，Hcy側(cè)鏈的巰基與羧基反應(yīng)，形成Hcy硫內(nèi)酯 (homocysteine thiolactone，HTL)[3]。 目 前 對(duì) 于HTL引起細(xì)胞損傷的機(jī)制尚不清楚，推測(cè)可能與誘導(dǎo)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的形成有關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)不僅是血液與血管平滑肌之間的生理屏障，也是一個(gè)高度活躍的代謝庫(kù)，它可以合成多種活性物質(zhì)，如一氧化氮(nitro oxide，NO)、內(nèi)皮素、緩激肽等，在調(diào)節(jié)血管的舒縮活動(dòng)與血液的流動(dòng)性方面起著十分重要的作用[4]。高Hcy血癥可引起血管功能損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，Hcy的致病作用主要與Hcy在體內(nèi)生成了HTL有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)模型，觀察HTL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的直接損傷作用，旨在從細(xì)胞和分子水平探討HTL損傷內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制，尋找其干預(yù)靶點(diǎn)，探索治療途徑。

材料和方法

1 試劑與儀器

HTL、NADPH氧化酶抑制劑夾竹桃麻素(apocynin，Apo)、NF－κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)、胰蛋白酶和 DMSO(Sigma)。DMEM培養(yǎng)基(Gibco)。小牛血清(杭州四季青公司)。HUVECs細(xì)胞株從北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所購(gòu)買(來源于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，屬于正常的 HUVECs，vWF抗原陽(yáng)性，編號(hào) CRL－2480，具有貼壁生長(zhǎng)、接觸抑制、密度依賴性等生物學(xué)特征)。NO試劑盒、NF－κB活性試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒和MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。Anti－IκBα(BioLegend)。TNF－α和sICAM－1的ELISA試劑盒(ADL)?？寡趸瘎㎞－乙酰半胱氨酸(N－acetyl cysteine，NAC，碧云天生物技術(shù)研究所)。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

DMEM用純化水溶解，NaHCO3調(diào)pH值至7.2－7.4，濾過除菌后4℃保存。小牛血清56℃，30 min滅活補(bǔ)體后分裝，－20℃凍存。臨用時(shí)培養(yǎng)基加入相應(yīng)量的小牛血清與青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)。

UV755B型紫外分光光度計(jì)(上海儀器廠)、CO2培養(yǎng)箱(FORMA311，上海瑞仰凈化裝備有限公司)、IX70型倒置相差顯微鏡(Olympus)、IJ－6A低溫離心機(jī)(Beckman)、Eppendorf離心機(jī)(Eppendorf)、Model 3.9 EL酶標(biāo)儀(Bio－Rad)、PE2400PCR儀(Perkin－Elmer)、Gel Doc 2000分子成像儀(Bio－Rad)和熒光顯微鏡(Olympus)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組 實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)正常對(duì)照組:用DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞;(2)HTL處理組:分別用含有0.1、0.3、1 mmol/L HTL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞;(3)NAC+HTL組:在加入5 mmol/L NAC培養(yǎng)液孵育1 h后，再與HTL共同孵育內(nèi)皮細(xì)胞;(4)PDTC+HTL組:加入0.1 mmol/L PDTC培養(yǎng)液孵育1 h后，再與HTL共同孵育內(nèi)皮細(xì)胞;(5)Apocynin+HTL組:加入0.1 mmol/L Apo培養(yǎng)液孵育1 h后，再與HTL共同孵育內(nèi)皮細(xì)胞。

2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 取HUVECs解凍復(fù)蘇后加入含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，分別接種于100 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，每隔2－3 d換液1次，待細(xì)胞80%融合時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代。用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至1×107/L、3×107/L、1 ×108/L，然后分別將細(xì)胞接種于96、24、6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞80%融合時(shí)換成含1%小牛血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞達(dá)到同步化，然后分別加入不同的處理因素。

2.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 將培養(yǎng)至第4代的單層內(nèi)皮細(xì)胞按常規(guī)消化后制成細(xì)胞懸液，以每孔103－104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為150 μL。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)15 μL 37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄除孔內(nèi)的培養(yǎng)上清液。每孔中再加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使得結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性測(cè)定 LDH能夠催化乳酸生成丙酮酸，后者與2，4－二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈現(xiàn)棕紅色，顏色深淺可間接反映LDH的活性，通過比色法測(cè)定其吸光度，計(jì)算酶的活力。具體嚴(yán)格操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，按下列公式計(jì)算:

LDH(U/L)=(測(cè)定管A值－測(cè)定空白管A值)÷(標(biāo)準(zhǔn)管A值－標(biāo)準(zhǔn)空白管A值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(2 μmol/L)×1 000 mL×測(cè)試前樣品稀釋倍數(shù)。

2.5 NO的檢測(cè) 此法按試劑盒介紹操作，標(biāo)準(zhǔn)溶液用DMEM(+10%FBS)溶液進(jìn)行稀釋和配制，濃度為(μmol/L):0、1、2、10、20、40、60 和 100，樣品為細(xì)胞培養(yǎng)液上清。每孔分別加上述溶液50 μL、Griess reagent I、Griess Reagent II溶液。即刻用酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)的數(shù)值。

2.6 ROS的檢測(cè)[5]利用熒光探針 DCFH－DA進(jìn)行ROS的檢測(cè)。DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。DCF的熒光可反映細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。

用無血清培養(yǎng)液按照1∶1 000比率稀釋DCFH－DA，使終濃度為10 μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1 mL稀釋好的DCFH－DA。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH－DA。蓋玻片封片后熒光顯微鏡下觀察。使用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。

2.7 NF－κB活性的檢測(cè)[6]棄除培養(yǎng)液并用PBS液洗滌細(xì)胞1次。加固定液固定細(xì)胞15 min。棄除固定液，用PBS洗滌3次，每次3 min。用免疫染色封閉液室溫下封閉1 h，棄除免疫染色封閉液，加入NF－κB p65抗體，室溫下孵育1h并用PBS液洗滌3次，每次8 min。加入1 mL抗兔Cy3，室溫孵育1 h。洗滌液洗滌2次，每次5－10 min。加入1 mL細(xì)胞核染色液(DAPI)，吸除細(xì)胞核染色液，再用PBS液洗滌3次，每次5 min。滴加適量的抗熒光淬滅封片液，蓋玻片封片后熒光顯微鏡下觀察。NF－κB的染色為紅色熒光，細(xì)胞核的DAPI染色為藍(lán)色熒光。

2.8 免疫印跡法檢測(cè)IκBα 蛋白表達(dá)[7]細(xì)胞總蛋白提取:將1×108/L的細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板中，置5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%，換含1%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞處于靜止期。藥物處理后加入PBS沖洗3 次，加入 100 μL 細(xì)胞裂解液(20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1%Triton X － 100，1%sodium pyrophosphate，25 mmol/L β － glycerophosphate，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L Na3VO4，0.5 mg/L leupeptin，臨用時(shí)加入PMSF)置冰上裂解30 min，收集細(xì)胞。12 000 r/min、4℃離心30 min取上清液，按照BCA試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定蛋白濃度。蛋白質(zhì)SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳:裝備膠槽，制備分離膠加入膠槽，上層加入少量水。待分離膠聚合完全后，用去離子水洗滌。隨后灌注積層膠，插入梳子，待堆積膠聚合后，拔去梳子，用去離子水沖洗加樣孔去除殘留的未聚合的膠。將玻板裝入電泳槽中，加入電泳緩沖液。將樣品加入上樣孔，其中一孔加入5－10 μL預(yù)染的蛋白質(zhì)分子量marker。常規(guī)垂直電泳，待電泳結(jié)束后，卸下玻璃板取下凝膠，對(duì)凝膠進(jìn)行 Western blotting檢測(cè)。

Western blotting檢測(cè):使用電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白質(zhì)從聚丙烯酞胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，轉(zhuǎn)膜完畢，將膜放入封閉液中，室溫下封閉1 h。將IκBαⅠ抗按1∶500稀釋加入封閉液中，50 r/min離心，4℃過夜。洗滌Ⅰ抗，用兔IgGⅡ抗1∶10 000稀釋后加入，室溫下1 h，洗滌Ⅱ抗。避光加入ECL溶液，反應(yīng)5 min，濾除多余的ECL液，在將膜放入顯影夾于暗室中顯影，曝光3 min，將膜顯影、定影。根據(jù)顯色條帶適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間和顯影時(shí)間使條帶更清晰。

2.9 TNF－α和sICAM－1濃度測(cè)定 采用雙抗體夾心ELISA法，檢測(cè)TNF－α和sICAM－1水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 HTL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞與 HTL(1 mmol/L)孵育6 h、12 h和24 h后均能時(shí)間依賴性地降低內(nèi)皮細(xì)胞的活力，以24 h最明顯;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)孵育24 h后可以濃度依賴性地降低內(nèi)皮細(xì)胞活力，以1 mmol/L最明顯。因此用HTL 1 mmol/L孵育24 h作為實(shí)驗(yàn)濃度與時(shí)間。如表1所示，1 mmol/L HTL與內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育24 h可以顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞活力(P＜0.01)，而PDTC、Apo與NAC均能夠不同程度地抑制HTL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活力的下降(P＜0.01)。

表1 各組處理因素對(duì)HTL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活性、LDH、NO和ROS的影響Table 1.Influence of different group on cell viability，LDH，NO and ROS in ECs induced by HTL(±s.n=3)

表1 各組處理因素對(duì)HTL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活性、LDH、NO和ROS的影響Table 1.Influence of different group on cell viability，LDH，NO and ROS in ECs induced by HTL(±s.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs HTL.

Group Cell viability LDH(U/L) NO(10－6mmol/L)ROS Control 0.89 ±0.09 84.3 ±7.2 24.7 ±3.1 0.11 ±0.01 HTL(1 mmol/L) 0.39 ±0.07＊＊ 172.7 ±12.4＊＊ 7.6 ±1.6＊＊ 0.37 ±0.02＊＊NAC(5 mmol/L)+HTL 0.80 ±0.10## 110.5 ±10.8## 18.5 ±2.1## 0.16 ±0.01##Apo(0.1 mmol/L)+HTL 0.75 ±0.08## 131.6 ±11.2## 16.1 ±2.0## 0.13 ±0.01##PDTC(0.1 mmol/L)+HTL 0.71 ±0.08## 125.3 ±13.1## 13.5 ±1.9## 0.23 ±0.02##

2 HTL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性的影響

如表1所示，HTL(1 mmol/L)與內(nèi)皮細(xì)胞孵育24 h顯著增加培養(yǎng)液LDH活性，PDTC、Apo與NAC均能夠不同程度地抑制HTL誘導(dǎo)的LDH活性的增加(P＜0.01)。

3 HTL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NO水平的影響

HTL(1 mmol/L)孵育6 h、12 h或24 h后均能顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞中NO含量，以24 h最明顯;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)作用24 h后可以劑量依賴性地降低內(nèi)皮細(xì)胞中NO的含量，以1 mmol/L最為明顯。因此用HTL 1 mmol/L孵育24 h作為實(shí)驗(yàn)的濃度與時(shí)間。如表1所示，1 mmol/L HTL與內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育24 h可以降低內(nèi)皮細(xì)胞中NO的含量，PDTC、Apo與NAC能夠不同程度地升高內(nèi)皮細(xì)胞中的NO含量(P＜0.01)。

4 HTL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中ROS水平的影響

HTL(1 mmol/L)作用1 h、3 h或6 h后均能顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞中ROS含量(P＜0.01)，以3 h最明顯;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)作用3 h后可以劑量依賴性地增加內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的含量，以1 mmol/L最為明顯。因此用HTL 1 mmol/L孵育3 h作為實(shí)驗(yàn)濃度與時(shí)間。如表1及圖1所示，預(yù)先使用0.1 mmol/L Apo、5 mmol/L NAC和0.1 mmol/L PDTC均能夠顯著減少內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生(P＜0.01)。

Figure 1.Influence of different treatments on ROS production in ECs(fluorescence microscope， × 200)A:positive control group;B:negative control group;C:HTL(1 mmol/L)group;D:PDTC(0.1 mmol/L)+HTL group;E:NAC(5 mmol/L)+HTL group;F:Apo(0.1 mmol/L)+HTL group.圖1 各組處理因素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平的影響

5 HTL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中NF－κB活性的影響

HTL(1 mmol/L)作用1 h、3 h或6 h后均能顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞中NF－κB的激活，其中以3 h最明顯;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)作用3 h后可以劑量依賴性地增加內(nèi)皮細(xì)胞中NF－κB的活性。因此用HTL 1 mmol/L孵育3 h作為實(shí)驗(yàn)濃度與時(shí)間。如圖2所示，預(yù)先使用0.1 mmol/L PDTC、0.1 mmol/L Apo和5 mmol/L NAC均可以顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞中NF－κB的激活。

Figure 2.Influence of different treatments on NF － κB in ECs(fluorescence microscope，×400).A:merged;B:DAPI staining for nuclei(blue);C:NF － κB p65(red).圖2 各組處理因素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NF－κB活性的影響

6 HTL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中IκBα蛋白表達(dá)的影響

圖3顯示的是HTL(1 mmol/L)作用0 h、0.5 h、1 h、3 h和6 h對(duì)IκBα蛋白表達(dá)的時(shí)效關(guān)系，從1 h以后HTL均能顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞中IκBα蛋白的水平，其中以3 h最明顯。因此用HTL 1 mmol/L孵育3 h作為實(shí)驗(yàn)濃度與時(shí)間。如圖4所示，與正常組相比，1 mmol/L HTL與內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育3 h后，可以顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞中IκBα蛋白的表達(dá)，預(yù)先使用0.1 mmol/L PDTC、0.1 mmol/L Apo和 5 mmol/L NAC均可以顯著增高內(nèi)皮細(xì)胞中IκBα蛋白的水平。

Figure 3.Effect of HTL(1 mmol/L)on IκBα protein expression in ECs at different time points.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 h.圖3 HTL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞IκBα蛋白表達(dá)的時(shí)效關(guān)系

7 HTL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中sICAM－1和TNF－α濃度的影響

HTL(1 mmol/L)作用6 h、12 h和24 h均能顯著升高內(nèi)皮細(xì)胞上清液sICAM－1和TNF－α濃度，以24 h最明顯;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)作用 24 h 后可以劑量依賴性地升高內(nèi)皮細(xì)胞上清液中的sICAM－1、TNF－α濃度，以1 mmol/L最為明顯。因此用HTL 1 mmol/L孵育24 h作為實(shí)驗(yàn)濃度與時(shí)間。如表2所示，預(yù)先使用 PDTC 0.1 mmol/L、Apo 0.1 mmol/L、5 mmol/L NAC可以顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞中sICAM－1、TNF－α濃度(P＜0.01)。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，HTL顯著誘導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞活力下降，LDH漏出增加，抗氧化劑NAC、Apo以及NF－κB抑制劑PDTC與血管內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)孵，顯著減輕了HTL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活力降低、LDH漏出。

Figure 4.Influence of different treatments on IκBα protein expression in ECs.1:control group(3 h);2:HTL(1 mmol/L，3 h)group;3:PDTC(0.1 mmol/L)+HTL(1 mmol/L，3 h)group;4:NAC(5 mmol/L)+HTL(1 mmol/L，3 h)group;5:Apo(0.1 mmol/L)+HTL(1 mmol/L，3 h)group.±s.n=3.*P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs HTL.圖4 不同時(shí)候HTL對(duì)IκB－α蛋白表達(dá)的影響

表2 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中sICAM－1和TNF－α水平Table 2.Influence of different treatments on sICAM －1 and TNF－α content in culture supernatants of ECs(ng/L.±s.n=3)

表2 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中sICAM－1和TNF－α水平Table 2.Influence of different treatments on sICAM －1 and TNF－α content in culture supernatants of ECs(ng/L.±s.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs HTL.

Group sICAM－1(ng/L) TNF－α(ng/L)Control 338.6 ±22.3 82.1 ±9.0 HTL(1 mmol/L) 1 025.8 ±33.7＊＊ 321.5 ±16.4＊＊NAC(5 mmol/L)+HTL 565.2 ±29.5## 180.2 ±15.1##Apo(0.1 mmol/L)+HTL 608.1 ±30.1## 168.3 ±12.3##PDTC(0.1 mmol/L)+HTL 532.2 ±25.2## 192.6 ±14.6##

氧化應(yīng)激即體內(nèi)ROS的蓄積。細(xì)胞內(nèi)活性氧的來源多種多樣，除線粒體呼吸鏈代謝產(chǎn)生以外，現(xiàn)有研究證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞中的ROS主要來源于NADPH氧化酶途徑。NADPH氧化酶是細(xì)胞內(nèi)一種可誘導(dǎo)性電子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，利用NAD(P)H作為電子供體被單電子還原而催化氧分子生成超氧陰離子[6，7]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HTL可以顯著增加ROS的產(chǎn)生，給予NADPH氧化酶抑制劑Apo以及NAC可以明顯降低細(xì)胞中ROS含量。

NF－κB是一種由p50以及p65兩種亞基組成的異源二聚體，未被激活時(shí)和IκBα形成一個(gè)復(fù)合物，分布在細(xì)胞漿中。在炎癥因子、生長(zhǎng)因子或趨化因子等可以激活NF－κB的刺激存在的情況下，IκBα?xí)赟er32和Ser36被磷酸化，隨后被泛素－蛋白酶體途徑降解。NF－κB和IκBα解聚后，其核定位序列被暴露，從而被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)NF－κB依賴的基因轉(zhuǎn)錄。NF－κB轉(zhuǎn)錄因子家族成員調(diào)控許多與炎癥相關(guān)的基因表達(dá)，如 TNF－α、IL－1、ICAM－1、VCAM－1等，而這些因子在動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)均起重要作用[8，9]。大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)NF－κB的胞質(zhì)－核轉(zhuǎn)位，而抗氧化劑如NAC、PDTC能抑制IκB激酶的活性，阻止其被磷酸化和最終被降解，抑制NF－κB的轉(zhuǎn)位[10－11]。因此，氧化應(yīng)激激活 NF － κB 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)可能是通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而引起IκB磷酸化和最終被降解。本實(shí)驗(yàn)所用NF－κB激活－核轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè)試劑盒僅染色p65，不染色RelB、C－Rel、p50和p52，使用后NF－κB呈紅色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。通過免疫染色檢測(cè)NF－κB的主要亞基p65是否被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，就可以判斷NF－κB是否被激活。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HTL增加了細(xì)胞中ROS的生成，降低了IκB的蛋白表達(dá)水平，1 mmol/L HTL可以明顯激活NF－κB;而預(yù)先給予Apo、NF－κB抑制劑PDTC和抗氧化劑NAC均可顯著提高IκBα的蛋白表達(dá)水平，從而抑制NF－κB的激活。

血管內(nèi)皮功能紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化最早的特征之一，而這種內(nèi)皮功能紊亂的一個(gè)重要原因是血管壁的慢性炎癥刺激。正常血管內(nèi)膜通常不發(fā)生白細(xì)胞黏附，但是在動(dòng)脈硬化的早期階段，隨著內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，在刺激因子的介導(dǎo)下，內(nèi)皮細(xì)胞開始表達(dá)包括TNF－α、ICAM－1等炎癥因子。研究發(fā)現(xiàn)，ICAM－1是介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互結(jié)合、相互作用的一類位于細(xì)胞膜表面的糖蛋白，主要參與炎癥細(xì)胞的黏附與聚集[12];TNF－α是觸發(fā)血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)子，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生IL－6、上調(diào)ICAM－1的表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，HTL可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生大量的TNF－α、sICAM－1，而預(yù)先給予Apo以及PDTC、NAC可以顯著地降低內(nèi)皮細(xì)胞中TNF－α、sICAM－1的濃度。

綜上所述，本研究證實(shí)同型半胱氨酸硫內(nèi)酯引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷可以通過激活NADPH氧化酶導(dǎo)致氧化應(yīng)激，活化NF－κB并且使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)造成炎癥因子sICAM－1、TNF－α的增多有關(guān)。

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