于棟華，張穎，徐紅英，于純淼

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

水蛭(Hirudo)為水蛭科動物螞蟥的干燥全體，是傳統(tǒng)中藥材，具有破血、逐瘀、通經(jīng)之功效［1］。水蛭藥性峻猛，是常用的破血藥。國內(nèi)以寬體金線蛭為主流商品［2］，臨床上多用此類水蛭?，F(xiàn)代研究表明，水蛭在抗凝血、抗血栓形成等方面表現(xiàn)出強(qiáng)烈的生物活性，可用于心腦血管疾病的治療［3］。水蛭中有效成分水蛭素(Hirudin)是一種非常穩(wěn)定的抗凝血蛋白質(zhì)。研究表明［4］，水蛭素性質(zhì)穩(wěn)定，單純溫度升高(100℃水浴)和pH值的改變(1～13)不影響其活力。只有當(dāng)溫度和pH值同時(shí)升高時(shí)其活力才開始下降，在pH=13的條件下經(jīng)80℃處理15min即完全失活。水蛭素與凝血酶的親和力極強(qiáng)，1μg水蛭素可中和5μg凝血酶，相應(yīng)摩爾比為1∶1，即中和一個國際單位(NIH單位)的凝血酶需要一個抗凝單位(lAT－μ)的水蛭素［5］。

作者通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得出單純的水煎或單純醇提效果都不如水提醇沉的抗凝效果好。故采用水提醇沉的方法對水蛭進(jìn)行提取。以雙縮脲比色法結(jié)合凝血酶滴定法計(jì)算其比活力為指標(biāo)，考察煎煮時(shí)間、乙醇濃度、醇沉?xí)r間和加水量對水蛭提取物的影響，選擇最佳工藝路線，并確定水蛭提取制備工藝。

1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

寬體金線蛭(山東水產(chǎn)養(yǎng)殖中心);纖維蛋白原(美國Sigma公司);凝血酶(美國Sigma公司);牛血清白蛋白(美國Sigma公司);雙縮脲試劑(上海榮盛生物技術(shù)有限公司);Tris堿;95%乙醇;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;離心機(jī);水浴鍋。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 水蛭素含量的測定—凝血酶滴定法［6］

取纖維蛋白原0.25g，溶于50mL的Tirs－HCl緩沖液(pH值≈7.4)中，得0.5%的纖維蛋白原溶液。稀釋凝血酶到5NIH/mL。取200μL纖維蛋白原溶液，加入100μL水蛭提取液，并滴加凝血酶，當(dāng)出現(xiàn)膠凍狀凝塊時(shí)即為滴定終點(diǎn)，從滴定的凝血酶用量即可推算出待測樣品中的水蛭素的活力單位數(shù)。

2.2 水蛭素蛋白含量測定—雙縮脲法

取一系列試管分別加入 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液(6mg/mL)，用水補(bǔ)足至2mL，在37℃下分別加入4mL雙縮脲試劑，用分光光度計(jì)在540nm處測定其吸光度，吸光度(A)分別為0.000、0.099、0.200、0.304、0.399、0.500。以 A 為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白含量(C)為橫坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。其線性方程為 A=0.041 7c+0.000 05(R=0.999 9)。取圖1雙縮脲比色法測蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線2.0mL待測樣品按上述方法測及吸光度。計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用測得的蛋白質(zhì)含量結(jié)合用凝血滴定法測得的數(shù)據(jù)，可求出待測樣品中水蛭素的比活力:比活力(ATU/mg)=水蛭素的活力單位數(shù)/蛋白含量。

3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

3.1 因素水平表 見表1。

表1 因素水平表

3.2 正交實(shí)驗(yàn)方法及數(shù)據(jù)

將水蛭藥材粉碎成粗粉，稱取10g，共9份，按表2中L9(34)設(shè)計(jì)方法分別提取。提取液過濾，濃縮至50mL，按表2進(jìn)行醇沉后，醇沉液離心取上清液，回收乙醇濃縮至50mL。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

直觀分析表明，以水蛭素比活力為標(biāo)準(zhǔn)，在所選因素水平范圍內(nèi)，四因素影響大小順序?yàn)镈(醇沉?xí)r間)＞A(煎煮時(shí)間)＞C(醇沉濃度)＞B(加水量)，最佳提取條件為A2B1C3D2，即水蛭粗粉加(20+10)倍水煎煮(60+30)min后，提取液80%乙醇醇沉24h。

3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

分別稱取3份水蛭粗粉，按優(yōu)選工藝A2B1C3D2，重復(fù)提取3次，得平均比活力為38.357 ATU/mg，RSD=2.33%，表明試驗(yàn)所確定的最佳工藝為較優(yōu)工藝。

4 結(jié)論

水蛭素的檢測方法還未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，目前以單一方法檢測水蛭素優(yōu)選水蛭提取工藝實(shí)驗(yàn)較多。本實(shí)驗(yàn)過程利用了水蛭素和凝血酶Ⅱ的配比關(guān)系測定不同條件水蛭提取液的水蛭活力單位數(shù)，并結(jié)合蛋白質(zhì)含量的測定，以水蛭素比活力為標(biāo)準(zhǔn)，確定了水蛭提取的最佳條件。此方法有較好的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，(20+10)倍水煎煮(60+30)min后，提取液80%乙醇醇沉24h條件最佳。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:57.

［2］ 呂文海，公素琴，杜征國，等.水蛭飲片規(guī)格質(zhì)量的調(diào)查及實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中藥雜志，1995，20(11):665 －668.

［3］ 董曉云，饒高雄，林亞明，等.以抗凝血活性指標(biāo)篩選水蛭的提取工藝［J］.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，25(3):23 －25.

［4］ 周進(jìn)科，劉翠萍.凝血酶抑制劑－水蛭素［J］.中國新藥雜志，1997，6(3):186.

［5］ 于秉新，李愛君，邵民象.水蛭開發(fā)與臨床應(yīng)用［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2000，11(2):179 －180.

［6］ 陳華友，邢自力，李媛媛，等.凝血酶滴定法測定水蛭素活性的改進(jìn)［J］.生物技術(shù)，2002，12(6):24 －25.