一種快速提取質(zhì)粒DNA鑒別重組克隆的方法

何冬蘭,余金龍,邵坤彥,邵潔云

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢430074)

一種快速提取質(zhì)粒DNA鑒別重組克隆的方法

何冬蘭,余金龍,邵坤彥,邵潔云

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢430074)

依據(jù)快檢緩沖液篩選重組子克隆的方法,結(jié)合堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理,經(jīng)過試驗(yàn)摸索,應(yīng)用了快檢緩沖液直接裂解菌液,電泳后篩選重組質(zhì)粒的方法,避免了提取質(zhì)粒鑒定等繁瑣步驟,其結(jié)果與菌液PCR、質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果一致,可快速篩選出重組克隆.

堿裂解法;快檢緩沖液;重組質(zhì)粒

常規(guī)方法篩選陽性克隆通常是一項(xiàng)繁瑣而耗時的工作.近年來,文獻(xiàn)[1,2]研究了菌落PCR篩選重組克隆子的方法,即挑取單菌落作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,此法簡便但費(fèi)用較高;采用堿裂解菌液后直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳[3],通過檢查質(zhì)粒DNA有無滯后現(xiàn)象也可快速篩選出重組子,但條帶較多不便觀察;采用快檢緩沖液的方法挑取單菌落進(jìn)行電泳[4],可將重組子的篩選過程縮短至2 h內(nèi),提高了篩選效率,成本低,但操作過程中注意事項(xiàng)比較多.

筆者在運(yùn)用快檢緩沖液篩選重組克隆的過程中,從堿裂解法提取質(zhì)粒DNA方法得到啟發(fā),將培養(yǎng)好的菌液經(jīng)快檢緩沖液裂解后,經(jīng)過處理直接進(jìn)行電泳篩選陽性克隆子,并驗(yàn)證其結(jié)果與菌液PCR、酶切篩選結(jié)果的一致與否.

1 材料和方法

1.1 菌株與載體

E.coliDH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存,載體pMD18-T購自TaKaRa公司.外源片段為雙生病毒衛(wèi)星DNAβ,大小約為1.4 kb,片段的克隆由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究中心分子微生物實(shí)驗(yàn)室完成.

1.2 試劑

快檢緩沖液的配制(50 mL),參照文獻(xiàn)[4]方法:2.5mL 2mol/L N aOH;2.5mL 10%SDS;0.5 mL 0.5 mol/L EDTA;2.5 mL 1mol/L T ris-HCl pH 8.0;42 mL H2O.

1.3 快檢緩沖液裂解菌液法篩選陽性克隆

從轉(zhuǎn)化平板中隨機(jī)挑取單菌落,接種于3mL液體培養(yǎng)基中(含有20μg/mL氨芐青霉素),37℃,250 r/m in振蕩培養(yǎng)6～8 h后,取菌液1.5 mL加入到EP管中,12000 r/m in離心30 s,小心棄上清,向EP管中加入80μL快檢緩沖液,振蕩器上振蕩2 m in后置于65℃水浴鍋中溫育5m in,室溫冷卻后,12000 r/m in離心5 m in,取上清5μL進(jìn)行電泳檢測,同時以自連載體或標(biāo)準(zhǔn)M arker為對照.

2 結(jié)果與分析

2.1 快檢結(jié)果、菌液PCR以及酶切驗(yàn)證

從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取8個單菌落培養(yǎng)后經(jīng)快檢緩沖液裂解,電泳檢測結(jié)果見圖1.由圖1可見:利用快檢緩沖液法提取的重組質(zhì)粒帶型和用TaKaRa公司試劑盒提取重組質(zhì)粒的結(jié)果一致.

圖1 1.4 kb的外源片段連接在pMD18-T載體上的快檢結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of the exogenous fragments(1.4 kb)connect w ith pMD18-T vector

2.2 菌液PCR鑒定

分別以菌液作為模板,以原擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證,結(jié)果見圖2.圖2中,8號為對照,沒有擴(kuò)增出目的片段,快檢為陽性的樣品均擴(kuò)增得到預(yù)期大小(約1.4 kb)目的片段.

圖2 菌液PCR鑒定Fig.2 Detection of bacteria solution by PCR amplification

圖3 質(zhì)粒酶切結(jié)果Fig.3 Restriction enzyme disgestion of the recombinant plasm ids

2.3 重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證

通過菌液PCR驗(yàn)證為陽性克隆,選取其中1號和3號管,進(jìn)一步抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證,酶切結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒經(jīng)B amH1和H indⅢ單酶切后,線性化亮帶約在4.0 kb位置,載體pMD18-T約為2.7 kb,經(jīng)過雙酶切可以得到目的片段條帶(約1.4 kb),通過驗(yàn)證,目的條帶所在位置正確,轉(zhuǎn)化子為含有目的插入片段的重組質(zhì)粒.

3 討論

1)在利用快檢緩沖液裂解菌液后,將其置于65℃水浴鍋中進(jìn)行溫育,當(dāng)基因組DNA用RN ase A處理時,為避免在室溫下RN ase A中混有的DN ase降解DNA,推薦選用65℃水浴,因?yàn)樵谠摐囟认?DN ase活性幾乎喪失[5],而RN ase A活性依然很高,處理效果較好,減少背景干擾.經(jīng)裂解后留在菌液中的為大腸桿菌染色體DNA和質(zhì)粒DNA,而染色體DNA較大,經(jīng)離心后,與菌體一起沉淀到下層,質(zhì)粒DNA處于上清液中.

2)在運(yùn)用快檢緩沖液裂解菌液法進(jìn)行陽性克隆篩選時,比較了裂解提取的質(zhì)粒DNA與TaKaRa公司質(zhì)粒小量抽提試劑盒所提取的質(zhì)粒DNA,發(fā)現(xiàn)兩者質(zhì)粒帶型一致,而用自配快檢緩沖液裂解法操作步驟簡單易行,方便省時,除了簡化常規(guī)方法操作步驟外,其成本低廉,大幅度節(jié)省了試驗(yàn)費(fèi)用,為質(zhì)粒提取試劑盒的開發(fā)提供了一種很好的借鑒思路.

綜上所述,使用快檢緩沖液裂解菌液法篩選重組質(zhì)粒切實(shí)可行,并有較好的重復(fù)性,為避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果,最好設(shè)立對照以確保最終結(jié)果的準(zhǔn)確性.由于樣品僅需簡單處理即可進(jìn)行鑒定,從而避免原有方法在處理樣品時必須提取質(zhì)粒,PCR擴(kuò)增和酶切鑒定等繁瑣步驟,使得在篩選重組子的過程中,工作效率大為提高,并節(jié)約了實(shí)驗(yàn)室成本,是一種快速、簡便篩選陽性克隆的好方法.

[1] 張傳生,耿立英,楊娜娜,等.PCR快速篩選重組克隆方法的建立 [J].生物技術(shù),2005,15(1):43-44.

[2] 陳書霞,王小武,房玉林,等.單菌落PCR法直接快速鑒定重組克隆 [J].微生物學(xué)通報(bào),2006,33(3):52-56.

[3] 熊 敏,李 青,李文涵,等.一種堿裂解菌液直接電泳快速篩選重組子的方法 [J].生物技術(shù),2005,15(1):51-52.

[4] 張桂敏,劉 振,李春華,等.一種簡便快速篩選重組子的方法 [J].湖北大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,27(3):280-281.

[5] 張穎慧,魏東盛,刑來君,等.一種改進(jìn)的絲狀真菌DNA提取方法[J].微生物學(xué)通報(bào),2008,35(3):466-469.

A RapidM ethod for Preparation of Plasm id DNA for Screen ing Recombinant Clones

H e D ong lan,Yu J inlong,S hao K unyan,S hao J ieyun
(College of L ife Science,South-CentralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China)

A ccording to themethod of screening recombinant clones by the specific lysis buffer in combination w ith the principle of the alkaline lysis extraction plasm id DNA,the bacterial solution was directly lysed in the specific lysis buffer for screening recombinant clones.This procedure el im inates the cumbersome steps of plasm id extraction and identification as well as that of PCR and plasm id DNA restriction enzyme disgestion.The method could screen recombinant clones rapidly.

alkaline lysis;specific lysis buffer;recombination clones

Q 753

A

1672-4321(2011)01-0037-02

2011-02-01

何冬蘭(1964-),女,教授,研究方向:分子微生物學(xué),E-mail:ymhlh@yahoo.com.cn

國家民委自然基金資助項(xiàng)目(PM ZY02002)