李錚，馮力更，鄭喆，廖萍，羅永康

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京100083)

糖基化反應(yīng)條件對乳清蛋白
——麥芽糖復(fù)合物抗原性的影響

李錚，馮力更，鄭喆，廖萍，羅永康

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京100083)

研究了將麥芽糖通過糖基化引入到乳清蛋白制備乳清蛋白-麥芽糖，用間接競爭ELISA法測定不同反應(yīng)時(shí)間不同質(zhì)量比的乳清蛋白-麥芽糖中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性的變化。結(jié)果表明，糖基化能有效降低α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性，α-乳白蛋白的抗原性可以從26.2 mg/L降低到14.4 mg/L，β-乳球蛋白的抗原性可以從95.1 mg/L降低到22.4 mg/L。反應(yīng)時(shí)間對不同質(zhì)量比的乳清蛋白-麥芽糖中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性有較大影響。蛋白與糖的質(zhì)量比為1～8時(shí)，反應(yīng)相同時(shí)間的乳清蛋白-麥芽糖中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性隨蛋白與糖的質(zhì)量比的下降而下降。

乳清蛋白；麥芽糖；糖基化；抗原性

0 引言

乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是引起牛乳過敏的主要過敏原[1]，通過改性降低乳清蛋白過敏原的主要方法有熱處理、高壓[2]、酶解[3]、糖基化、發(fā)酵[4]等。目前有一些關(guān)于糖基化反應(yīng)降低乳清蛋白抗原性的報(bào)道,Enomoto等[6]將麥芽五糖結(jié)合到α-LA上，降低了α-LA的抗原性。Corzo-Martinez[7]將半乳糖和塔格糖引入到β-LG，有效的降低了β-LG的抗原性。另外有研究表明通過糖基化反應(yīng)將低聚果糖和三甲基殼聚糖分別結(jié)合到大豆蛋白和卵清蛋白上，能有效的降低其抗原性[10，11]。

目前還沒有關(guān)于將麥芽糖通過糖基化反應(yīng)引入到乳清蛋白對α-LA和β-LG抗原性影響的研究，本研究旨在通過糖基化反應(yīng)將麥芽糖引入到乳清蛋白制備乳清蛋白-麥芽糖，探索反應(yīng)時(shí)間和蛋白與糖的質(zhì)量比對乳清蛋白-麥芽糖中α-LA和β-LG抗原性的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

乳清分離蛋白（WPI）；麥芽糖；α-乳白蛋白（α-LA），L5385；β-乳球蛋白(β-LG)，L3908；兔抗α-LA血清（自制）；兔抗β-LG血清（自制）；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，A6154。

1.2 方法

1.2.1 WPI-麥芽糖的制備

將WPI和麥芽糖按照質(zhì)量比8∶1，4∶1，2∶1和1∶1溶解于去離子水中，溶液最終質(zhì)量濃度為100 g/L。將溶液于-60℃中預(yù)凍6 h后，在-60℃冷凍干燥24 h左右。將冷凍干燥制得的凍干粉放入底部盛有飽和KBr（相對濕度79%）的干燥器中，60℃反應(yīng)0～120 h，所得WPI-麥芽糖共價(jià)復(fù)合物溶解于去離子水中，溶液最終質(zhì)量濃度為100 g/L，再次冷凍干燥，得到的凍干粉于-20℃冰箱中貯存。同時(shí)，將WPI在相同的干熱條件下處理作為對照樣品。

1.2.2 色澤測定

420 nm波長是美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的棕色產(chǎn)物的特征波長。將糖基化復(fù)合物溶解于去離子水中，使溶液中蛋白質(zhì)量濃度為1 g/L,測定其在420 nm處的吸光度值。

1.2.3 游離氨基酸殘留量測定

采用三硝基苯磺酸法（TNBS法）。取0.25 mL的樣品（1 L中含有的氨基量在0.25×10-3～2.5×10-3之間）與2 mL磷酸緩沖溶液（pH=8.2）和2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的TNBS溶液混合，在50℃的暗室中放置60 min。反應(yīng)完畢后，用4 mL濃度為0.1 moL/L的HCl終止反應(yīng)，在室溫下放置30 min，于420 nm下測其吸光值。用濃度為0～5.0×10-3moL/L亮氨酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換成亮氨酸的濃度。游離氨基酸殘留量即為糖基化反應(yīng)后的WPI-麥芽糖中游離氨基酸的濃度與未反應(yīng)的WPI中游離氨基酸的濃度的比值。

1.2.4 乳清蛋白-麥芽糖抗原性的測定

采用間接競爭ELISA法。

(1)抗原包被。用包被液（濃度為50 mmol/L，pH值為9.6的碳酸鹽溶液）將一定質(zhì)量濃度的抗原（α-LA質(zhì)量濃度0.5 mg/L；β-LG質(zhì)量濃度1 mg/L）包被于96孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，4℃過夜。

(2)樣品和抗血清預(yù)混合。在反應(yīng)管中加入蛋白質(zhì)量濃度為0.1 g/L的樣品（或標(biāo)準(zhǔn)品）和相同體積一定稀釋度（α-LA，1︰256 000；β-LG，1︰128 000）的抗血清。不加樣品（或標(biāo)準(zhǔn)品）只加抗血清的反應(yīng)管作為無競爭體系，4℃冰箱過夜。

(3)洗滌。次日傾去孔內(nèi)液體，PBST（PBS+0.05%Tween-20）洗滌4次，每次3 min，于吸水紙上拍干。

(4)封閉。加封閉液（PBS+1%BSA+0.1%Tween-20）進(jìn)行封閉，每孔100 μL，37℃1 h，PBST洗滌4次，拍干。

(5)抗原抗體反應(yīng)。加入（2）中樣品和抗血清的預(yù)混液，每孔100 μL，37℃1 h，PBST洗滌4次，拍干。

(6)加酶標(biāo)二抗。加入稀釋10 000倍的羊抗兔IgGHRP標(biāo)記物，每孔100 μL，37℃反應(yīng)1 h，PBST洗滌4次，拍干。

(7)顯色。加入新鮮配制的TMB底物溶液，每孔100 μL，37℃反應(yīng)10 min，顯示藍(lán)色。

(8)終止反應(yīng)。每孔加入濃度為2 mol/L的H2SO450 μL終止反應(yīng)，顏色變?yōu)辄S色。

(9)吸光值測定。利用酶標(biāo)儀雙波長測定各孔的OD450和OD630值，實(shí)際OD=OD450-OD630。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成系列濃度，進(jìn)行間接競爭ELISA測定。將各濃度對應(yīng)的OD值轉(zhuǎn)換成B/B0%值，無抗原抑制時(shí)的OD值為B0,各相應(yīng)濃度抗原抑制時(shí)的OD值為B，以B/B0%為縱坐標(biāo)，以相對應(yīng)濃度的對數(shù)lg[α-LA]（或lg[β-LG]）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線上B/B0%與lg[α-LA]（或lg[β-LG]）呈明顯相關(guān)的區(qū)段根據(jù)公式Logit(B/B0%)=ln[B/(B0-B)]計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的Logit(B/B0%),再做對應(yīng)于lg[α-LA](或lg[β-LG])的Logit(B/B0%)回歸分析,得出線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品的抗原性。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)時(shí)間對WPI-麥芽糖的色澤的影響

圖1為反應(yīng)時(shí)間對不同質(zhì)量比的WPI-麥芽糖色澤的影響。由圖1可以看出，干熱處理的WPI在420 nm處的吸光值僅有很少的增加，這可能是由于WPI所含的微量的乳糖與WPI發(fā)生了輕微的糖基化反應(yīng)[12]。WPI與麥芽糖的糖基化產(chǎn)物在420 nm處的吸光值顯著增加，這表明發(fā)生了糖基化反應(yīng)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長及蛋白與糖質(zhì)量比的降低，吸光值增加，即棕色物質(zhì)逐漸增多，說明糖基化程度加深。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對WPI-麥芽糖色澤的影響

2.2 反應(yīng)時(shí)間對WPI-麥芽糖中游離氨基酸殘留量的影響

圖2為反應(yīng)時(shí)間對不同質(zhì)量比的WPI-麥芽糖游離氨基酸殘留量的影響。糖基化反應(yīng)會引起蛋白中游離氨基酸的變化。由圖2可知，在60℃干熱處理120 h的WPI的游離氨基酸殘留量為90%，這可能是因?yàn)閃PI與乳糖發(fā)生了輕微的糖基化反應(yīng)。糖基化的WPI-麥芽糖中的游離氨基酸殘留量顯著降低，表明WPI與麥芽糖之間發(fā)生了交聯(lián)。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長及蛋白與糖質(zhì)量比的降低，WPI-麥芽糖中游離氨基酸殘留量逐漸降低，這表明糖基化程度加深。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對WPI-麥芽糖游離氨基酸殘留量的影響

2.3 反應(yīng)時(shí)間對WPI-麥芽糖抗原性影響

圖3和圖4為反應(yīng)時(shí)間對不同質(zhì)量比的WPI-麥芽糖中α-LA和β-LG抗原性的影響。由圖3可知，熱處理WPI中α-LA的抗原性隨時(shí)間延長而增加，60℃熱處理120 h時(shí)α-LA抗原性增加到196 μg/mL，與無處理的WPI相比，增加了6倍多。蛋白與糖質(zhì)量比為1～8，糖基化產(chǎn)物中α-LA的抗原性隨蛋白與糖的質(zhì)量比的下降而下降，但是當(dāng)?shù)鞍着c糖的質(zhì)量比小于2時(shí)，增加糖的用量對α-LA的抗原性影響不大。本研究還測定了將蛋白與糖的質(zhì)量比為4︰1時(shí)α-LA的抗原性，結(jié)果與質(zhì)量比為2︰1的沒有明顯差距，因此在圖3沒有顯示。不同比例的WPI-麥芽糖中α-LA的抗原性隨反應(yīng)時(shí)間的延長變化規(guī)律不同，蛋白與糖質(zhì)量比為8︰1反應(yīng)120 h內(nèi)的糖基化產(chǎn)物中α-LA的抗原性隨時(shí)間延長而顯著增加；質(zhì)量比為4︰1反應(yīng)120 h內(nèi)的糖基化產(chǎn)物中α-LA的抗原性隨時(shí)間延長先略微降低然后升高，反應(yīng)48 h后高于初始值；質(zhì)量比為2︰1和1︰1反應(yīng)120 h內(nèi)的糖基化產(chǎn)物中α-LA的抗原性基本接近并且都低于初始值。Enomoto[6]研究表明，α-LA與麥芽五糖質(zhì)量比2︰1，50℃反應(yīng)72 h α-LA的抗原性略有降低，與本研究相似。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對WPI-麥芽糖中α-LA抗原性的影響

圖4 反應(yīng)時(shí)間對WPI-麥芽糖中β-LG抗原性影響

由圖4可以看出，熱處理WPI中β-LG抗原性隨時(shí)間延長而增加，60℃熱處理120 h時(shí)β-LG抗原性從94 mg/L增加到194 mg/L。蛋白與糖質(zhì)量比為1～8，糖基化產(chǎn)物中β-LG的抗原性隨蛋白與糖的質(zhì)量比的下降而下降，這與質(zhì)量比對α-LA的抗原性的影響相似。蛋白與糖質(zhì)量比為8︰1和4︰1反應(yīng)120 h內(nèi)的糖基化產(chǎn)物中β-LG的抗原性先降低后升高，質(zhì)量比為4︰1的糖基化產(chǎn)物中β-LG的抗原性始終低于初始值；蛋白與糖質(zhì)量比為2︰1反應(yīng)24 h內(nèi)β-LG抗原性顯著降低，24-120 h隨時(shí)間延長逐漸升高；蛋白與糖質(zhì)量比為1︰1反應(yīng)24 h內(nèi)β-LG的抗原性顯著降低，24～120 h內(nèi)無顯著變化。Hattori[8，9]等將殼聚糖、磷?；途厶?、海藻酸低聚糖通過糖基化反應(yīng)結(jié)合到β-LG上，β-LG的抗原性降低的效果不同，與本研究中麥芽糖對β-LG的抗原性的影響也不同，這說明不同的糖對β-LG的抗原性的影響不同。

熱處理WPI中α-LA和β-LG的抗原性隨反應(yīng)時(shí)間延長而增加，布冠好熱處理WPI溶液也得到了相似的結(jié)果[14]，這可能是由于蛋白空間結(jié)構(gòu)的展開導(dǎo)致分子內(nèi)部抗原表位的暴露[13]。WPI-麥芽糖中α-LA和β-LG的抗原性比熱處理WPI中的低，說明糖基化能有效降低熱處理WPI的抗原性，這可能是因?yàn)橐氲柠溠刻瞧帘瘟薟PI中的抗原表位。由圖1和圖2可知，120 h內(nèi)糖基化程度隨時(shí)間的延長而加深，但是α-LA和β-LG的抗原性并不是逐漸降低，這可能是因?yàn)樘腔帘蔚谋砦缓蜔崽幚肀┞兜谋砦煌瑫r(shí)影響糖基化產(chǎn)物的抗原性，當(dāng)麥芽糖屏蔽的表位多于熱處理暴露的表位時(shí)，抗原性低于初始值，當(dāng)麥芽糖屏蔽的表位少于熱處理暴露的表位時(shí)，抗原性高于初始值。

3 結(jié)論

(1)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，WPI-麥芽糖的顏色加深，游離氨基酸殘留量降低，即糖基化程度增加。

(2)在一定條件下，WPI與麥芽糖糖基化能有效降低WPI中α-LA和β-LG的抗原性，WPI-麥芽糖中α-LA和β-LG的抗原性隨蛋白與糖的質(zhì)量比(1～8范圍內(nèi))的下降而下降，反應(yīng)時(shí)間對不同質(zhì)量比的WPI-麥芽糖中α-LA和β-LG的抗原性的有較大影響。

(2)綜合考慮抗原性低、糖的添加量小和反應(yīng)時(shí)間短3個(gè)因素，最適反應(yīng)條件為蛋白與糖的質(zhì)量比為2︰1，反應(yīng)24 h。

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Effect of Glycosylation reaction conditions on the Antigenicity of WPI-Maltose Conjugate

LI Zheng,FENG Li-geng,ZHENG Zhe,LIAO Ping,LUO Yong-kang
(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Maltose was conjugated to WPI by means of glycosylation to form WPI-maltose.After the protein and sugar of different mass ratio reacting for different time,the antigenicity of α-LA and β-LG were estimated by indirect competition ELISA.The results indicated that the glycosylation of WPI can reduce the antigenicty of α-LA and β-LG.The antigenicity of α-LA can be reduced from 26.2 mg/L to 14.4 mg/L,and the antigenicity of β-LG can be reduced from 95.1 mg/L to 22.4 mg/L.Reaction time have much effect on the antigenicity of α-LA and β-LG in the WPI-maltose of different mass ratio.On condition of the same reaction time,the antigenicity of α-LA and β-LG were declined as the mass ratio of protein and sugar decreased from 8 to 1.

whey protein;maltose;glycosylation;antigenicity

Q936

A

1001-2230（2011）01-0008-04

2010-08-30

國家自然基金資助項(xiàng)目（30471224；30871817）；“十一五”國家科技支撐項(xiàng)目(2006BAD04A06)。

李錚（1986-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。

羅永康