響應(yīng)面分析法優(yōu)化竹節(jié)草黃酮提取工藝

吳冬青，徐新建，張 麗，安紅鋼，林 敏

(河西學(xué)院化學(xué)系，甘肅 張掖 734000)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化竹節(jié)草黃酮提取工藝

吳冬青，徐新建，張 麗，安紅鋼，林 敏

(河西學(xué)院化學(xué)系，甘肅 張掖 734000)

研究超聲波輔助法提取竹節(jié)草黃酮工藝。利用響應(yīng)面分析法對影響竹節(jié)草黃酮得率的4個主要因素(提取時間、提取功率、乙醇體積分數(shù)和固液比)進行研究。結(jié)果表明：最佳的竹節(jié)草黃酮提取工藝參數(shù)為提取時間39min、提取功率70W、乙醇體積分數(shù)65%、固液比1:21(g/mL)。在此條件下黃酮得率實測值為20.07mg/g，實測值與回歸模型預(yù)測值(20.29mg/g)相對誤差為1.1%，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件可靠。

竹節(jié)草；黃酮；響應(yīng)面法；提取工藝

竹節(jié)草(Polygomun aviculane L.)，又稱扁竹蓼、烏蓼、扁蓄等，為蓼科蓼屬植物，主要分布在我國的西部地區(qū)。其全草可入藥，是我國民間常用的一種中草藥，主治細菌性痢疾、腮腺炎等癥，也可用作婦科止血劑[1]。

黃酮類化合物是植物的次級代謝產(chǎn)物，在自然界分布廣泛，且具有顯著的抗炎、抗衰老、抗氧化等功效[2]。超聲波提取方法是新發(fā)展起來的一種提取物質(zhì)有效成分方法，具有提取時間短、得率高特點[3]。采用超聲波提取物質(zhì)有效成分是目前常用方法之一。本實驗利用超聲波法提取竹節(jié)草中黃酮類化合物，為確定竹節(jié)草黃酮類化合物的最佳提取工藝，選擇提取時間、提取功率、乙醇體積分數(shù)、固液比為自變量，以竹節(jié)草黃酮得率為響應(yīng)值，借助Design Expert Version 7.1.6軟件設(shè)計進行了中心組合試驗，對提取工藝進行優(yōu)化，旨在為竹節(jié)草黃酮的進一步開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹節(jié)草采集甘肅省隴南市成縣。

蘆丁(生化試劑) 中國醫(yī)藥(集團)上海化學(xué)試劑公司；95%乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WFJ2100型可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海青浦滬西儀器廠；SN-2000直插式超聲波發(fā)生器 廣州辛諾科超聲設(shè)備公司。

1.3 方法

1.3.1 竹節(jié)草黃酮提取工藝[4-7]

工藝流程：竹節(jié)草→洗凈→晾干→粉碎→過60目篩→80%乙醇→浸泡1h→超聲→提取兩次→抽濾→濾液合并→減壓濃縮→定容→得黃酮備用液。

1.3.2 黃酮含量測定[4-7]

準確移取質(zhì)量濃度0.5mg/mL蘆丁標準溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加入5% NaNO20.5mL，搖勻，放置6min后，加入10%Al(NO3)30.5mL，搖勻，再放置6min，然后加4% NaOH溶液5mL，用30%乙醇定容，搖勻，放置10min后，在波長510nm處測定吸光度(以試劑空白為參比)，以樣品質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標作圖，得回歸直線方程：A=0.4785x－0.006，R2=0.9997。

黃酮得率/(mg/g)=xd/m

式中：d為稀釋倍數(shù)，m為樣品質(zhì)量g。

1.3.3 響應(yīng)面法試驗設(shè)計[8-15]

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，借助Design Expert軟件，采用中心組合試驗設(shè)計(central composite design，CCD)原理，選取提取時間、提取功率、乙醇體積分數(shù)、固液比為試驗因素，以竹節(jié)草黃酮得率為試驗指標，進行響應(yīng)面分析試驗，試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 竹節(jié)草黃酮提取響應(yīng)面法試驗的因素水平編碼Table 1 Factors and levels in central composite design

根據(jù)CCD中心組合試驗設(shè)計方案進行試驗，用統(tǒng)計軟件Design Expert Version 7.1.6對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，可推測出最佳提取工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹節(jié)草黃酮提取響應(yīng)面法試驗優(yōu)化設(shè)計與結(jié)果

按照CCD中心組合試驗方案進行4因素5水平試驗，試驗結(jié)果見表2。

將表2試驗數(shù)據(jù)采用軟件Design Expert Version 7.1.6進行多元回歸分析，各試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，試驗因素對響應(yīng)值影響的回歸方程為：

4個試驗因素均以量綱線性編碼處理，方程中各項系數(shù)絕對值的大小能反映各因素對響應(yīng)值的影響程度。

表2 竹節(jié)草黃酮提取CCD響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Central composite design arrangement and experimental results

2.2 回歸方程的方差分析

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of regression equation for the yield of flavonoids

采用Design Expert Version 7.1.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行ANOVA分析，結(jié)果見表3。

由表 3 可看出，X1、X4、X12、X22、X32、X42對黃酮得率的影響極顯著，X3對黃酮得率影響高度顯著，X1X4、X3X4兩個交互項對黃酮得率影響顯著，其他項系數(shù)均不顯著。擬合模型檢驗極顯著(P＜0.001)，方程決定系數(shù)R2=0.9852，說明該方程與實際情況擬合良好，可以用該方程代替真實實驗點進行分析。

2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

圖1 各因素交互作用對黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plot showing the effects of any two factors on the yield of flavonoids

根據(jù)回歸模型作出了各個因素交互作用的響應(yīng)曲面和等高線見圖1。

由圖1A可看出，提取時間和提取功率對黃酮得率的交互影響顯著。隨提取功率增大，黃酮得率先增后減；隨著提取時間增加，總黃酮得率也是先增后減，提取時間增長，黃酮得率反而降低，這由于超聲時間過長，對有效成分結(jié)構(gòu)有所破壞。當提取時間在40min左右和提取功率在70W左右區(qū)域范圍黃酮得率較高。

由圖1B可看出，提取時間和乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的交互影響與圖1A相比較，對響應(yīng)值交互影響的范圍相對比較窄。當提取功率、固液比不變的情況下，乙醇體積分數(shù)65%、提取時間39min時，黃酮得率最佳。

由圖1C可看出，隨著提取時間增加，總黃酮得率是先增后減，但變化不很顯著；提取時間在35～40min區(qū)域黃酮得率隨固液比的增加而增加，但固液比大于1:27響應(yīng)值增加緩慢。溶劑量加大，會造成回收溶劑時間較長，能源消耗較大。因此，從成本考慮溶劑加入量要適宜。

由圖1D可看出，提取功率和乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的交互影響顯著，隨著提取功率、乙醇體積分數(shù)的增大，黃酮得率是一個升高而后又降低的過程。在提取功率為70W、乙醇體積分數(shù)為65%附近可達到響應(yīng)值最高點。

由圖1E可看出，黃酮得率與提取功率呈現(xiàn)較明顯的二次拋物線關(guān)系，固液比對黃酮得率的影響較提取功率顯著。提取功率在60～80W、固液比在1:25附近可達到響應(yīng)值最高點。

由圖1F可看出，乙醇體積分數(shù)和固液比對黃酮得率有交互影響，固液比對響應(yīng)值的影響明顯強于乙醇體積分數(shù)，乙醇體積分數(shù)在60%～70%范圍內(nèi)，隨固液比增大響應(yīng)值增大，乙醇體積分數(shù)在80%～90%范圍內(nèi)，隨固液比增大響應(yīng)值先增后降。經(jīng)分析，乙醇體積分數(shù)在65%、固液比1:20附近響應(yīng)值可達到較高值。

總體來看，固液比4個試驗因素中固液比對響應(yīng)值影響最為顯著。

2.4 提取條件優(yōu)化

為確定各因素的最佳取值，利用Design Expert軟件進行嶺脊分析。通過分析，得出回歸模型存在最大值點，黃酮得率最大預(yù)測值為20.29mg/g，各因素X1(提取時間)、X2(提取功率)、X3(乙醇體積分數(shù))、X4(固液比)對應(yīng)的編碼值分別為－0.08、－0.03、－0.47、0.28。其對應(yīng)的竹節(jié)草黃酮提取最佳工藝參數(shù)為提取時間39.2min，提取功率69.7W，乙醇體積分數(shù)65.3%，固液比1:21.4。為了便于實際操作，最終確定竹節(jié)草黃酮提取最佳工藝參數(shù)為提取時間39min，提取功率70W，乙醇體積分數(shù)65%，固液比1:21(g:mL)。為了檢驗響應(yīng)面法的可行性，在以上優(yōu)化條件下進行5次驗證實驗，結(jié)果表明，理論值20.29mg/g與實驗平均值20.07mg/g相對誤差為1.1%，說明該方程與實驗情況擬合很好，響應(yīng)面對竹節(jié)草黃酮提取工藝的優(yōu)化是可行的，得到的黃酮提取工藝具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié) 論

3.1 采用響應(yīng)面法對影響竹節(jié)草黃酮提取工藝的提取時間、提取功率、乙醇體積分數(shù)、固液比4個主要因素進行方差分析。結(jié)果表明：X1、X4、X12、X22、X32、X42對黃酮得率的影響極顯著；X3對黃酮得率的影響高度顯著；X1X4、X3X4對黃酮得率影響顯著，說明試驗因素與響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。方差分析顯示擬合模型檢驗極顯著，同時決定系數(shù)為0.9852，說明回歸方程能很好的預(yù)測竹節(jié)草黃酮得率隨各因素變化的規(guī)律。3.2 利用統(tǒng)計學(xué)方法建立了二次多項式模型，確定黃酮最佳提取工藝參數(shù)：提取時間39min，提取功率70W，乙醇體積分數(shù)65%，固液比1:21(g/mL)，回歸模型預(yù)測黃酮得率(20.29mg/g)與實驗平均值(20.07mg/g)相對誤差1.1%，表明將響應(yīng)面設(shè)計引用到竹節(jié)草黃酮提取工藝研究可行、結(jié)果可靠。

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Optimization of Extraction Process for Flavonoids from Polygomun aviculane L. by Response Surface Methodology

WU Dong-qing，XU Xin-jian，ZHANG Li，AN Hong-gang，LIN Min
(Department of Chemistry, Hexi University, Zhangye 734000, China)

Ultrasound assistance was applied to extract flavonoids from Polygomun aviculane L. using aqueous ethanol as extraction solvent. Four main factors (extraction time, ultrasound power, ethanol concentration and solid-to-liquid ratio) affecting the yield of flavonoids were optimized by response surface methodology. The results showed that the optimal extraction conditions were extraction time of 39 min, ultrasound power of 70 W, ethanol concentration of 65%, and solid-to-liquid ratio of 1:21 (g/mL). Under these conditions, the observed yield of flavonoids was 20.07 mg/g, and the relative error in comparison with the predicted one was 1.1%, suggesting that the optimal extraction conditions are reliable.

Polygomun aviculane；flavonoids；response surface method；extraction technique

TS201.1

A

1002-6630(2011)08-0125-04

2010-07-04

甘肅省高等學(xué)校研究生導(dǎo)師科研項目(1009-08)；

甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室面上項目(XZ1008)

吳冬青(1961—)，女，教授，本科，研究方向為天然產(chǎn)物有效成分提取、純化和分析。E-mail：hxuwdq@163.com